一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用，所述细胞系包含猪塞内加谷病毒3A基因，并且能够稳定表达猪塞内加谷病毒3A蛋白；所述构建方法包括3A基因的扩增、重组慢病毒载体pLV/3A的构建、293T细胞的培养和细胞系的构建步骤。本发明专利技术细胞系能够稳定高效表达猪塞内加谷病毒蛋白，可用于制备猪塞内加谷病毒疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用。
技术介绍
猪塞内加谷病毒(SVV)属于小核糖核酸病毒科Senecavirus病毒属成员，可引起猪鼻镜及蹄冠处出现水疱、溃烂创面从而导致跛足甚至死亡。SVV为无囊膜的单股正链RNA病毒，基因组编码5个结构蛋白L、VP1、VP2、VP3和VP4，编码7个非结构蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D。L、VP1、VP2、VP3和VP4在SVV结构组装中发挥重要作用，2A、2B、2C、3A、3B、3C和3D在SVV复制和转录中发挥重要作用。目前关于用慢病毒技术稳定表达3A蛋白仍未见报道。公告号为CN110279855B的中国专利公开了一种免疫组合物，其包含：猪塞内卡病毒结构蛋白VP3和VP1蛋白，以及，猪塞内卡病毒结构蛋白VP2和/或VP4蛋白。进一步的，所述免疫组合物还可包括猪塞内卡病毒结构蛋白VP0。所述免疫组合物可用于制备猪塞内卡病毒新型基因工程亚单位疫苗，该疫苗的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对动物没有致病性，并且该疫苗可以通过生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，大大降低了疫苗生产成本。但是，该专利只是评价病毒结构蛋白的免疫原性，没有考虑病毒非结构蛋白在机体免疫反应中的重要作用。公开号为CN110358741A的中国专利技术专利申请公开了一种表达猪塞内卡病毒VP2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用。该专利技术提供一种重组杆状病毒，其包含一个或多个拷贝的猪塞内卡病毒VP2蛋白的编码基因。该专利技术还提供猪塞内卡病毒亚单位疫苗，其包含采用所述重组杆状病毒表达的猪塞内卡病毒VP2蛋白。该专利技术通过人工密码子优化，实现了猪塞内卡病毒的VP2蛋白的高水平、高纯度表达，最大程度地保留了VP2蛋白的免疫原性。该专利技术提供的猪塞内卡病毒亚单位疫苗具有优异的免疫原性和高度的安全性，对猪塞内卡病毒的感染发挥理想的免疫保护效果。但是，该专利只能用一种特定细胞和特定培养基培养，增加了生产成本。
技术实现思路
为克服上述缺陷，本专利技术的目的在于提供表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系、构建方法和应用。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系，所述细胞系包含猪塞内加谷病毒3A基因，并且能够稳定表达猪塞内加谷病毒3A蛋白。优选地，所述3A基因的序列如SEQIDNO.1所示；所述3A蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。一种上述的表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系的构建方法，包括以下步骤S1、3A基因的扩增；S2、重组慢病毒载体pLV/3A的构建：a.双酶切3A基因与pLV质粒b.3A基因与pLV连接反应体系为：10*Buffer：2μL；T4-DNA-Ligase：1μL；3A基因：1.05μL；pLV：3.14μL；ddH2O：12.81μL；反应条件为：PCR仪16℃连接6h；c.转化感受态细胞将步骤b得到的连接液加入到DH5α感受态细胞中，在不含Amp+抗性的LB液体培养基，37℃摇床培养1h，最后分离涂板；d.挑菌在超净台下用接种环挑取白色单个菌落，接种于含Amp+抗性的LB培养液中，37℃摇床培养12h；e.从步骤d得到的培养液中提取重组质粒pLV/3A；S3、293T细胞的培养将293T细胞株置于含10％小牛血清的DMEM培养液中，37℃、5％CO2条件下培养箱中培养得到；S4、细胞系的构建：a.将步骤S3培养得到的293T细胞用10％的DMEM培养液培养至细胞长至75-85％，更换培养液为5％FBS的生长培养液，37℃、CO2培养箱中继续培养；b.脂质体介导的转染：将pLV/3A与PMD2.G、psPAX2混合，并加入转染试剂中，混匀，室温静置，加入步骤a培养的293T细胞中，24h收集上清液，然后更换培养基为10％的DMEM培养液，继续培养24h后，第二次收集上清液，合并两次上清液，超速离心浓缩得到慢病毒；c.取PK15细胞接种于24孔板，待细胞长至70-80％时，转导步骤b得到的慢病毒，培养箱中培养，得到细胞系。优选地，步骤S1所述3A基因的扩增包括以下步骤：(1)设计引物：所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物3A-F，序列为：AAGGAAAAAATGTACAAGGGAGGAGGCGGATCTGGAGGAGGCGGATCATGAGCCCTAACGAGAACGACGA；下游引物3A-R，序列：CGCGGATCCGCCTAGCTCCTAGGCGCTTTAGCAG；(2)PCR扩增：将步骤(1)所得设计引物进行PCR扩增，扩增产物在琼脂凝胶上跑胶；(3)基因的纯化与回收：将步骤(2)跑胶得到的含有目的条带的琼脂凝胶进行纯化和回收，得到DNA溶液。优选地，步骤(3)中所述DNA溶液A260/A280比值大于1.80，且核酸浓度≥70μg/ml。优选地，所述PCR扩增体系为：2X：25μL；dNTP：1μL；上游引物：2μL；下游引物：2μL；高保真酶：1μL；cDNA模板5μL；ddH2O：14μL；反应步骤：首先94℃预变性10min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，总共循环35次，最后72℃延伸10min。优选地，所述基因的纯化与回收包括以下步骤：1)将PCR扩增后琼脂糖凝胶置于紫外灯下，然后切取目的片段，放于1.5ml的离心管中，称重；2)根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖加300-600μLBufferB2的比例加入BufferB2；3)将离心管置于50℃水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化；4)将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8000Xg离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；5)向吸附柱中加入300μLBufferB2，8000Xg离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；6)向吸附柱中加入500μLWashSolution，9000Xg离心30s，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；7)重复步骤6)一次；8)将空吸附柱和收集管放入离心机，9000Xg离心1min；9)在吸附膜中央加入15-40μLElutionBuffer，室温静置1-2min，9000Xg离心1min，得到的DNA溶液。优选地，所述重组质粒pLV/3A的提取包括以下步骤：(1)取5mL步骤S2d中挑菌步骤中的摇床振荡培养12h后的菌液分入五个1.5mLEP管中，8000xg离心2min，收集菌体，弃尽培养基；(2)在一个EP管中加入250μLBufferP1，将沉淀全部悬浮；(3)加入250μLBufferP2，立即温和颠倒离心管5-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系，其特征在于，所述细胞系包含猪塞内加谷病毒3A基因，并且能够稳定表达猪塞内加谷病毒3A蛋白。/n

【技术特征摘要】
1.一种表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系，其特征在于，所述细胞系包含猪塞内加谷病毒3A基因，并且能够稳定表达猪塞内加谷病毒3A蛋白。


2.根据权利要求1所述的表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系，其特征在于，所述3A基因的序列如SEQIDNO.1所示；所述3A蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。


3.一种权利要求1或者2所述的表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤
S1、3A基因的扩增；
S2、重组慢病毒载体pLV/3A的构建：
a.双酶切3A基因与pLV质粒
b.3A基因与pLV连接
反应体系为：10*Buffer：2μL；T4-DNA-Ligase：1μL；3A基因：1.05μL；pLV：3.14μL；ddH2O：12.81μL；反应条件为：PCR仪16℃连接6h；
c.转化感受态细胞
将步骤b得到的连接液加入到DH5α感受态细胞中，在不含Amp+抗性的LB液体培养基，37℃摇床培养1h，最后分离涂板；
d.挑菌
在超净台下用接种环挑取白色单个菌落，接种于含Amp+抗性的LB培养液中，37℃摇床培养12h；
e.从步骤d得到的培养液中提取重组质粒pLV/3A；
S3、293T细胞的培养
将293T细胞株置于含10％小牛血清的DMEM培养液中，37℃、5％CO2条件下培养箱中培养得到；
S4、细胞系的构建：
a.将步骤S3培养得到的293T细胞用10％的DMEM培养液培养至细胞长至75-85％，更换培养液为5％FBS的生长培养液，37℃、CO2培养箱中继续培养；
b.脂质体介导的转染：将pLV/3A与PMD2.G、psPAX2混合，并加入转染试剂中，混匀，室温静置，加入步骤a培养的293T细胞中，24h收集上清液，然后更换培养基为10％的DMEM培养液，继续培养24h后，第二次收集上清液，合并两次上清液，超速离心浓缩得到慢病毒；
c.取PK15细胞接种于24孔板，待细胞长至70-80％时，转导步骤b得到的慢病毒，培养箱中培养，得到细胞系。


4.根据权利要求3所述的表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤S1所述3A基因的扩增包括以下步骤：
(1)设计引物：
所述引物包括上游引物和下游引物，上游引物3A-F，序列为：AAGGAAAAAATGTACAAGGGAGGAGGCGGATCTGGAGGAGGCGGATCAATGAGCCCTAACGAGAACGACGA；下游引物3A-R，序列：CGCGGATCCGCCTAGCTCCTAGGCGCTTTAGCAG；
(2)PCR扩增：将步骤(1)所得设计引物进行PCR扩增，扩增产物在琼脂凝胶上跑胶；
(3)基因的纯化与回收：将步骤(2)跑胶得到的含有目的条带的琼脂凝胶进行纯化和回收，得到DNA溶液。


5.根据权利要求4所述的表达猪塞内加谷病毒蛋白的细胞系的构建方法，其特征在于，步骤(3)中所述DNA溶液A260/A280比值大于1.80，且核酸浓度≥70μg/ml。


6.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：董建国，饶丹，何书海，焦凤超，胡静，
申请(专利权)人：信阳农林学院，
类型：发明
国别省市：河南;41