促进表皮干细胞分化和生长的方法技术

本发明专利技术涉及促进表皮干细胞分化和生长的方法。本发明专利技术通过分离表皮干细胞，并制备获得了转CLL基因的表皮干细胞，该转基因的表皮干细胞能够特异性的促进Brn4蛋白的高表达。将所述的转基因表皮干细胞通过含有化合物的诱导剂进行诱导，获得了表皮干细胞来源的神经元细胞，通过检测所述神经元细胞的增殖活性以及神经元电特性，证明了诱导后的神经元细胞具有较好的增殖效果以及相应的神经元特性，具有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
促进表皮干细胞分化和生长的方法
本专利技术属于干细胞领域，具体的涉及促进表皮干细胞分化和生长的方法。
技术介绍
大脑中枢神经系统的细胞包括维持脑功能的功能性神经细胞和神经干细胞(NeuralStemCell,NSCs)。功能性神经细胞主要包括神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞等。神经干细胞具有自我増殖能力和多向分化的潜能的成体干细胞M。在生理状态下,死亡或者调亡的功能性神经细胞,由神经干细胞分化而来的功能性神经细胞取代。神经干细胞因其所具有的自我增殖能力和多向分化潜能,为神经系统的损伤修复和脑缺血疾病的治疗带来了新的曙光。大量实验研究证明,成年哺乳动物中枢神经系统内侧脑室室管膜下区和齿状回的颗粒下区都存在神经干细胞,脑缺血不仅可引发缺血细胞的局部死亡,同时也启动缺血周围组织的再生反应。神经干细胞通过増殖、迁移、分化、进一步整合到现存的神经系统网络来完成神经再生及修复损伤。内源性神经干细胞的修复作用不大，原因是干细胞的数量有限，微环境的不允许。此外，也有研究显示，移植的神经干细胞进入体内后，由于受到多种因素的影响，常保持未分化状态或大部分分化为胶质细胞。所以，促进神经干细胞向神经元分化的比例及增加神经元之间功能性突触的数量将成为神经功能修复的一条重要途径。近年来，人们在NSC增殖分化的调节因素、调控机制及应用方面做了大量的工作，取得了一些研究成果。但是，神经干细胞向神经元的分化是一个非常复杂的过程，受内外因素共同的调控。决定其分化的除内在的基因程序外，体内各种细胞因子的分泌和相互作用、细胞与细胞间的相互作用及环境因素都可能对之产生影响。更加具体的证实神经干细胞向神经元分化的过程、机制及影响因素仍旧是我们面临的复杂课题。骨髓间充质干细胞BMSCs可从成体.的非造血干细胞、骨髓、脂肪组织、皮肤中分离得到。在体外培养条件下,BMSCs具有贴壁性且可向成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞分化。hMSCs能够移植到大鼠大脑并分化成星形胶质细胞,MSCs为中枢神经系统(CentralNervousSystem,CNS)疾病的治疗提供了一个新的思路。在过去的几年里,来自不同物种如人(Human)、大鼠(Rat)、小鼠(Mouse)的MSCs向神经细胞分化都有相关的研究。诱导MSCs向神经细胞分化主要有三种方法:化合物诱导法,生长因子诱导法和神经样细胞培养方法。MSCs是属于中胚层的一类多能干细胞，具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌(肌腱)细胞、骨髓基质甚至肝脏细胞和神经细胞等多种细胞分化的能力。近几年来国内外已有多位学者证明骨髓组织中存在一类可分化为骨、软骨、脂肪、心肌、血管、神经等的MSCs。已有众多的体外试验研究表明MSCs具有多分化的潜能。实验证实脂肪组织中可能存在着一类干细胞，通过诱导可以使本来不表达NSE的细胞表达NSE，并在形态上表现为神经元。但是文献中报道诱导分化后的细胞最多只能说是早期幼稚神经元，它不具备成熟神经元的功能；也有一些学者认为，尽管证明诱导后的细胞可表达多种神经元非特异性标志物，但认为细胞的突起是由于细胞在外界刺激下胞浆皱缩，或者是由于细胞贴附在培养平面的结果，未发现成熟的神经元标志物，如微管相关蛋白-2、胶质神经元酸性原纤维蛋白等的表达。郑亚妮等证实了：用TrichostatinA(TSA)、RG-108、8-BrcAMP和Rolipram4种小分子物质对SD大鼠的ADSCs进行诱导分化，用免疫荧光形态学、免疫印迹和qRT-PCR等方法分别检测诱导前、后ADSCs神经元标志的表达，结果证明了小分子化合物可将ADSCs诱导分化为神经元样细胞，其可作为治疗神经系统疾病及损伤的干细胞移植的种子细胞。但是在以上研究中，没有针对人表皮干细胞向神经元分化的研究，更没有涉及能够又好、又快、效率更高的诱导方法。
技术实现思路
为了解决现有的表皮干细胞没有诱导成为神经元细胞的问题，本专利技术的目的是提供一种表皮干细胞来源的神经元细胞、制备方法及其在治疗中枢神经系统损伤中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术提供一种促进Brn4表达的CLL基因的高表达的转基因表皮干细胞。所述的CLL基因如SEQIDNO：1所示。该基因是研究表皮干细胞诱导分化时，通过分析诱导后的神经元细胞与诱导前的表皮干细胞的蛋白质表达谱的差异，筛选得到的。本专利技术的一个方面，提供一种诱导剂，组成为DMEM/F12+1％penicillin+20μg/LbFGF+20μg/L式(1)化合物。其中本专利技术涉及的式(1)化合物是在研究干细胞诱导剂时，筛选得到的具有诱导干细胞向神经元细胞诱导功能的化合物，该化合物作用的原理初步推定是提高细胞的代谢活性，从而提高某些控制分化的基因的转录表达水平。具体的作用机理，专利技术人后续会展开研究。进一步的，所述式(1)化合物结构式如式(1)所示。按照CN101437785B的方法合成制备得到式(1)化合物，也可以采用本领域常规的化合物合成的方法来制备所述的化合物。本专利技术的第二方面，提供采用上述诱导剂将表皮干细胞分化成神经元细胞的方法，包括以下步骤：取制备的表皮干细胞，经0.25％胰酶-EDTA消化后接种于多聚赖氨酸包被的24孔板中，细胞贴壁后更换培养液为诱导剂(实验组)：DMEM/F12+1％penicillin+20μg/LbFGF+20μg/L式(1)化合物，隔天半量换液。诱导7d。本专利技术的第三方面，提供表皮干细胞来源的神经元细胞的用途，用于制备治疗中枢神经系统损伤的药物。本专利技术的第四方面，提供一种药物组合物，上述的表皮干细胞来源的神经元细胞和药学上可接受的载体，所述表皮干细胞来源的神经元细胞的存在量足以在给予患者所述表皮干细胞来源的神经元细胞后促进中枢神经系统损伤患者的功能恢复。其中，所述表皮干细胞来源的神经元细胞的数量为1×106～1×107个。其中，所述药学上可接受的载体为生理盐水。有益效果与现有技术相比，本专利技术实现的有益效果：本专利技术通过分离表皮干细胞，并制备获得了转CLL基因的表皮干细胞，该转基因的表皮干细胞能够特异性的促进Brn4蛋白的高表达。将所述的转基因表皮干细胞通过含有化合物的诱导剂进行诱导，获得了表皮干细胞来源的神经元细胞，通过检测所述神经元细胞的增殖活性以及神经元电特性，证明了诱导后的神经元细胞具有较好的增殖效果以及相应的神经元特性，具有较好的应用前景。附图说明图1PCR结果图图2Brn4蛋白相对表达量结果图图3基因表达量图具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本专利技术进行进一步说明，不能理解为对本专利技术保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本
技术实现思路
对本专利技术做出一些非本质的改进和调整。实施例1表皮干细胞的制备取皮肤标本,无菌条件下将皮片标本用含庆大霉素800u/mlD-hank’s液漂洗3遍。用眼科剪将皮片剪成1cm*1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因的表皮干细胞，其特征在于将核苷酸序列为为SEQ ID NO：1所示的基因导入到表皮干细胞中获得。/n

【技术特征摘要】
1.一种转基因的表皮干细胞，其特征在于将核苷酸序列为为SEQIDNO：1所示的基因导入到表皮干细胞中获得。


2.一种促进表皮干细胞分化和生长的方法，包括以下步骤：
取权利要求1所述的转基因的表皮干细胞，经0.25％胰酶-EDTA消化后接种于多聚赖氨酸包被的24孔板中，细胞贴壁后更换培养液为诱导剂，所述诱导剂组成为：DMEM/F12+1％penicillin+20μg/LbFGF+20μg/L式(1)化合物，隔天半量换液，诱导7...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘欢，李蒙，
申请(专利权)人：北京广未生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11