基于CRISPR-Cas9构建基因编辑巨噬细胞的方法及构建的基因编辑巨噬细胞技术

本发明专利技术公开了一种基于CRISPR‑Cas9构建基因编辑巨噬细胞的方法及构建的基因编辑巨噬细胞，属于基因工程技术领域。本发明专利技术采用将Cas9质粒与sgRNA分两步电转的方法，一方面通过减少外源基因数量提高转染效率，另一方面构建成功的稳定表达Cas9的巨噬细胞可作为工具细胞进行其他基因的编辑，为后续巨噬细胞的基因编辑奠定基础。此外，本发明专利技术的sgRNA是在内含子上进行设计，可将整个外显子切除致使几百甚至上千个碱基丢失，用PCR扩增快速初筛，3h左右即可获得结果，在难以转染的巨噬细胞中大大提高了筛查效率。

【技术实现步骤摘要】
基于CRISPR-Cas9构建基因编辑巨噬细胞的方法及构建的基因编辑巨噬细胞
本专利技术涉及一种基于CRISPR-Cas9构建基因编辑巨噬细胞的方法及构建的基因编辑巨噬细胞，属于基因工程

技术介绍
基因功能分析对于解析细菌致病机制至关重要。近年来，在体内外模型中基因编辑三大利器包括锌指核酸酶(zinc-fngernucleases,ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases,TALEN)和成簇规律间隔短回文重复序列及相关蛋白9(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeats-Cas9，CRISPR-Cas9)系统广泛应用。早期的基因编辑工具ZFN技术是将蛋白传递到细胞内，此过程非常耗能，且准确性欠佳。随后TALEN技术的出现在提高成功率的同时降低脱靶率，但TALEN分子的模块组装和筛选过程繁杂，需大量测序，成本较高。CRISPR-Cas9系统广泛存在于原核生物基因中，是细菌和古细菌应对病毒和质粒不断攻击而演化来的免疫防御机制。该系统通过碱基互补配对特异性识别靶序列，并引导核酸酶Cas9蛋白剪切DNA双链，随后利用DNA损伤修复机制随机修复断裂双链DNA，引入基因突变，获得稳定转染的细胞系。尽管CRISPR-Cas9基因编辑技术在多种细胞及动物模型中广泛应用，然而作为具有吞噬功能的免疫细胞，巨噬细胞因识别外源核酸并启动免疫应答导致自身极化或死亡而难以转染，外源性质粒越大转染难度越大。病毒介导法虽可用于难以转染的细胞，但携带的基因过大或数量过多将降低转染效率，且考虑到生物安全因素，难以在一般实验室开展。因此，巨噬细胞因其抵抗外源性基因片段而难以编辑，成为CRISPR-Cas9基因编辑技术的一道难题，因此鲜有文献报道其在巨噬细胞基因编辑方面的应用。此外，sgRNA的设计与选择是Crispr-Cas9技术的精髓，也是实验是否成功的关键一步，它决定了Cas9的靶向性和特异性。研究表明，sgRNA的长度及两条sgRNA间的距离也可影响打靶效率。不同sgRNA的切点之间的距离越近，效率越高，以往研究常在外显子内部设计sgRNA进行打靶，然而打靶后仅产生几个碱基的缺口，无法通过PCR快速初筛，1-2天后方可获得结果。Surveyornucleaseassay利用突变的DNA序列与未突变的DNA序列进行杂交，形成异源双链后，特异性核酸内切酶surveyor可检测其点突变，相比于直接PCR扩增耗时长且成本高。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术采用将Cas9质粒与sgRNA分两步电转的方法，一方面通过减少外源基因数量提高转染效率，另一方面构建成功的稳定表达Cas9的巨噬细胞可作为工具细胞进行其他基因的编辑，为后续巨噬细胞的基因编辑奠定基础。本专利技术的第一个目的是提供一种基于CRISPR-Cas9构建基因编辑巨噬细胞的方法，所述方法是将Cas9质粒与sgRNA分步转化到巨噬细胞内。进一步地，所述的sgRNA是根据目的基因的内含子进行设计。进一步地，所述的巨噬细胞为缺失与细胞死亡相关的ASC的巨噬细胞RAW264.7。进一步地，所述的转化是通过电转化的方式进行转化。本专利技术的第二个目的是提供一种采用上述方法制备得到的gsdmd基因敲除的巨噬细胞。进一步地，所述的gsdmd基因敲除的巨噬细胞是通过先将Cas9质粒转入巨噬细胞RAW264.7中，再将含有根据gsdmd基因内含子设计的sgRNA的重组质粒转入巨噬细胞RAW264.7中得到。进一步地，所述的sgRNA为双向sgRNA。进一步地，所述的sgRNA的序列如SEQIDNO.1-4所示。进一步地，所述的重组质粒是以pGL3为载体。本专利技术的第三个目的是提供所述的gsdmd基因敲除的巨噬细胞在制备GSDMD介导的巨噬细胞死亡的细胞模型中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术采用将Cas9质粒与sgRNA分两步电转的方法，一方面通过减少外源基因数量提高转染效率，另一方面构建成功的巨噬细胞-Cas9可作为工具细胞进行其他基因的编辑，为后续巨噬细胞的基因编辑奠定基础。此外，本专利技术的sgRNA是在内含子上进行设计，可将整个外显子切除致使几百甚至上千个碱基丢失，用PCR扩增快速初筛，3h左右即可获得结果，在难以转染的巨噬细胞中大大提高了筛查效率。附图说明图1为gsdmd基因3号外显子敲除策略示意图；图2为构建靶向gsdmd基因3号外显子的pGL3-sgRNA载体；图3为qPCR检测RAW264.7细胞cas9转录水平(****P<0.0001)；图4为Westernblot检测RAW264.7细胞GSDMD蛋白水平；图5为比色法检测LDH释放水平(**P<0.01，****P<0.0001)。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本专利技术并能予以实施，但所举实施例不作为对本专利技术的限定。RAW264.7细胞是小鼠单核巨噬细胞，常用于炎症相关研究。由于缺失与细胞死亡相关的凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingaCARD,ASC)，RAW264.7细胞较能耐受外源性dsDNA电穿引起的细胞毒性。本专利技术通过利用CRISPR-Cas9系统构建gsdmd基因敲除的巨噬细胞RAW264.7为例。将Cas9质粒电转入RAW264.7构建RAW264.7-Cas9细胞；针对gsdmd基因靶向设计4条向导RNA(sgRNA)(图1)。构建pGL3-sgRNA串联载体(图2)，并共转染至RAW264.7-Cas9细胞中；药物筛选获得gsdmd-/-RAW264.7细胞；比色法检测鼠伤寒沙门菌野生株、spvC敲除株及回补株感染的gsdmd-/-RAW264.7细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放水平，发现spvC可抑制GSDMD介导的巨噬细胞死亡。利用CRISPR-Cas9系统成功构建gsdmd-/-RAW264.7细胞，为后续深入研究GSDMD在巨噬细胞中的生物学功能提供细胞模型。具体操作如下实施例所示：实施例1：基于CRISPR-Cas9系统构建gsdmd基因敲除RAW264.7细胞将2×106个RAW264.7细胞用100μl预热Opti-MEM重悬，与2μg带有G418抗性基因(neomycin-resistant)的Cas9质粒混匀，用Lonza电转仪中预存的条件进行电转。常规培养48h后换含500ng/mLG418的完全培养基药筛。无大片细胞死亡后换含250ng/mLG418完全培养基扩大培养。qPCR检测cas9基因mRNA转录水平，将稳定表达cas9基因的RAW264.7细胞命名为RAW264.7-Cas9(图3)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于CRISPR-Cas9构建基因编辑巨噬细胞的方法，其特征在于，所述方法是将Cas9质粒与sgRNA分步转化到巨噬细胞内。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR-Cas9构建基因编辑巨噬细胞的方法，其特征在于，所述方法是将Cas9质粒与sgRNA分步转化到巨噬细胞内。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的sgRNA是根据目的基因的内含子进行设计。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的巨噬细胞为缺失与细胞死亡相关的ASC的巨噬细胞RAW264.7。


4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的转化是通过电转化的方式进行转化。


5.一种采用权利要求1-4任一项所述的方法制备得到的gsdmd基因敲除的巨噬细胞。


6.根据权利要求5所述的巨噬细胞，...

【专利技术属性】
技术研发人员：周丽婷，叶颖，原海波，吴淑燕，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32