生物工程化的华通氏胶衍生的细胞外基质制造技术

本发明专利技术提供了源自脱细胞的华通氏胶基质(DWJM)的生物工程化的细胞外基质模型以及制备和使用它的方法。脱细胞后，DWJM被均化、冷冻，并在模具中被冻干以形成具有基本均匀的孔隙尺寸、孔隙分布和基质组分分布的模制支架，并且可被修剪和成形为任何所需的尺寸。生物工程化的DWJM能够保持所培养细胞的干细胞特性，这在筛选靶向癌症，特别是癌症干细胞群体的化疗药物方面是有用的。生物工程化的DWJM具有类似于骨造血生态位的基质组分，并且可用于扩增和维持造血干细胞以及促进骨再生和修复。

Extracellular matrix derived from bioengineering Watson's gum

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】生物工程化的华通氏胶衍生的细胞外基质相关申请的引证本申请要求2018年3月30日提交的美国临时专利申请第62/650,551号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
技术介绍
华通氏胶是脐带血管周围的粘液样多孔结缔组织。华通氏胶含有大量蛋白质、糖胺聚糖和生长因子，这使它成为合适的天然支架材料。脱细胞后，华通氏胶产生了多孔、可生物降解且生物相容的无细胞支架，并且保留了其细胞外基质蛋白。然而，由于脱细胞的华通氏胶基质(DWJM)的来源是脐带，所以DWJM的尺寸、厚度、组成和蛋白质分布在每根脐带之间，甚至在每根脐带的不同区域之间变化很大，这使得它难以以一致的方式使用。本领域需要改进的脱细胞华通氏胶基质构建体。本专利技术满足了这一需求。
技术实现思路
在一个方面，本专利技术提供了多孔基质，其包含中位孔隙尺寸范围为约200μm至约350μm的模制的脱细胞华通氏胶基质(DWJM)。在一个实施方案中，中位孔隙尺寸范围为约230μm至约330μm。在一个实施方案中，中位孔隙尺寸为约235μm、约275μm、约290μm、约300μm、约310μm、约320μm或约330μm。在一个实施方案中，孔隙尺寸分布不超过中位孔隙尺寸的50％或17％。在一个实施方案中，该基质的体积孔隙率在约80％与95％之间。在一个实施方案中，所述基质还包含均匀分布的基质组分，所述基质组分选自由以下组成的组：胶原蛋白、纤连蛋白、肌腱蛋白C(TN-C)、原纤蛋白、基膜聚糖蛋白、透明质酸(HA)、多功能蛋白聚糖(versican)、纤维蛋白原γ链、肌球蛋白-9、肌球蛋白-10、paladin、细丝蛋白、纽蛋白、膜突蛋白、骨膜蛋白、层粘连蛋白、踝蛋白-1及其组合。在一个实施方案中，该基质的纤维蛋白原γ链丰度比在约30与35之间。在一个实施方案中，该基质的肌球蛋白-9丰度比在约10与15之间。在一个实施方案中，该基质的肌球蛋白-10丰度比在约10与15之间。在一个实施方案中，该基质可被模制或修剪成尺寸适合于细胞培养孔的圆盘形状。在一个实施方案中，该基质还包含至少一个接种细胞的群体。在一个实施方案中，该基质还包含至少一种治疗剂。在另一方面，本专利技术提供了制备生物工程化的基质的方法，其包括以下步骤：将脱细胞的华通氏胶基质(DWJM)浸渍在液体介质中；对浸渍的DWJM执行一个或多个均化循环以形成均化的DWJM，每个均化循环包括均化期和休止期；将均化的DWJM成形；将均化的DWJM冷冻；以及将冷冻的DWJM在真空下冻干以形成生物工程化的基质。在一个实施方案中，液体介质是蒸馏水。在一个实施方案中，对保存在冰上的浸渍的DWJM执行一个或多个均化循环。在一个实施方案中，每个均化周期包括约30秒的均化期和约120秒的休止期。在一个实施方案中，每个均化期包括在浸渍的DWJM中激活分散混合器。在一个实施方案中，执行至少30个均化循环。在一个实施方案中，使用3D打印来对将均化的DWJM成形。在一个实施方案中，使用模具使均化的DWJM成形。在一个实施方案中，在约-80℃与-180℃之间执行冷冻步骤。在一个实施方案中，在约-20℃与-60℃之间、在约0.05毫巴下执行冻干步骤。在另一方面，本专利技术提供了促进受试者的骨再生的方法，其包括以下步骤：提供本专利技术的多孔基质；在该基质中载入一种或多种成骨和血管生成生长因子；以及将该多孔基质植入在受试者的骨缺损处。在另一方面，本专利技术提供了培养造血干细胞的方法，其包括将CD34+细胞接种到本专利技术的多孔基质上的步骤，其中细胞在多孔基质上培养时保持在静止期。在一个实施方案中，接种的CD34+细胞具有巨核细胞谱系偏倚。在另一方面，本专利技术提供了癌症模型，其包括本专利技术的多孔基质和包埋在多孔基质中的癌细胞群体。在一个实施方案中，癌细胞群体表现出癌症干细胞特征。在一个实施方案中，癌细胞群体选自由以下组成的组：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、脑癌、宫颈癌、肺癌、黑色素瘤、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、食道癌、肾癌、甲状腺癌、肝癌、子宫癌、软组织肉瘤、骨癌和胃癌。附图说明当结合附图阅读时，能更好地理解本专利技术实施方案的以下详细描述。然而，应该理解，本专利技术不限于附图中所示的实施方案的精确布置和手段。图1A至图1D描绘了之前公布的脱细胞华通氏胶基质(DWJM)的表征。(图1A)DWJM的代表性碎片。(图1B)DWJM的切片的H&E染色。(图1C)DWJM的SEM图像。(图1D)DWJM的TEM图像。图2A和图2B描绘了生物工程化的DWJM。(图2A)冻干后的生物工程化的DWJM片材。(图2B)冻干后的生物工程化的DWJM圆盘的SEM图像(左)。请注意中间图中的孔隙尺寸(31-79μm)和原发性白血病患者细胞在DWJM纤维上的附着(右)。图3A至图3C描绘了表征生物工程化的DWJM的结果。(图3A)生物工程化的DWJM的切片的SEM图像。(图3B)将生物工程化的DWJM的切片分成三个区域以进行表征。(图3C)表征每个区域的孔隙率和孔隙尺寸的结果(该结果展示了该孔隙率和孔隙尺寸的基本均匀性)。图4是示出表征图3B所示的生物工程化的DWJM的切片的每个区域中的孔隙尺寸分布的结果的曲线图。图5是示出图3B所示的生物工程化的DWJM的切片中所有三个区域的平均孔隙尺寸分布的曲线图。图6A至图6D是示出如通过质谱测定法确定的DWJM的切片与尺寸相当的示例性生物工程化的DWJM的切片之间的较丰富的基质组分的丰度比的图表。图7A至图7B是示出如通过质谱测定法确定的DWJM的切片与尺寸相当的示例性生物工程化的DWJM的切片之间的不太丰富的基质组分的丰度比的图表。图8是列出了用于制造生物工程化的DWJM的示例性方法的步骤的流程图。图9是示出DWJM中处于悬浮状态的原代白血病细胞(左)和处于贴壁状态的白血病细胞(右)的图。预测的触发糖酵解的细胞信号以贴壁状态示出。具体实施方式本专利技术提供了源自脱细胞的华通氏胶基质(DWJM)的生物工程化的细胞外基质模型以及制备和使用它的方法。脱细胞后，DWJM被均化、冷冻，并在模具中被冻干以形成具有基本均匀的孔隙尺寸、孔隙分布和基质组分分布的模制支架，并且可被修剪和成形为任何所需的尺寸。生物工程化的DWJM保持了所培养的细胞的干细胞特性，这对于筛选靶向癌症，特别是癌症干细胞群体的化疗药物是有用的。生物工程化的DWJM具有类似于骨造血生态位的基质组分，并且可用于扩增和维持造血干细胞以及促进骨再生和修复。定义应当理解，已经简化了本专利技术的附图和描述，以阐明与清楚理解本专利技术相关的元件，同时为了清楚起见，去除了本领域中通常存在的许多其它元件。本领域普通技术人员可以认识到，在实现本专利技术时，其它元件和/或步骤是期望的和/或需要的。然而，因为此类元件和步骤在本领域中是众公知的，并且因为它们不利于更好地理解本专利技术，所以本文不提供对此类元件和步骤的论述。本文的公开内容涉及本领域本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种多孔基质，其包含中位孔隙尺寸范围为约200μm至约350μm的模制的脱细胞华通氏胶基质(DWJM)。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180330 US 62/650,5511.一种多孔基质，其包含中位孔隙尺寸范围为约200μm至约350μm的模制的脱细胞华通氏胶基质(DWJM)。


2.如权利要求1所述的多孔基质，其中所述中位孔隙尺寸的范围为约230μm至约330μm。


3.如权利要求1所述的多孔基质，其中所述中位孔隙尺寸为约235μm、约275μm、约290μm、约300μm、约310μm、约320μm或约330μm。


4.如权利要求1-3中任一项所述的多孔基质，其中孔隙尺寸分布不超过所述中位孔隙尺寸的50％或17％。


5.如权利要求1-4中任一项所述的多孔基质，具有介于约80％与95％之间的体积孔隙率。


6.如权利要求1-5中任一项所述的多孔基质，还包含均匀分布的选自由以下组成的组的基质组分：胶原蛋白、纤连蛋白、肌腱蛋白C(TN-C)、原纤蛋白、基膜聚糖蛋白、透明质酸(HA)、多功能蛋白聚糖、纤维蛋白原γ链、肌球蛋白-9、肌球蛋白-10、paladin、细丝蛋白、纽蛋白、膜突蛋白、骨膜蛋白、层粘连蛋白、踝蛋白-1以及它们的组合。


7.如权利要求1-6中任一项所述的多孔基质，所述多孔基质的纤维蛋白原γ链丰度比在约30与35之间。


8.如权利要求1-7中任一项所述的多孔基质，所述多孔基质的肌球蛋白-9丰度比在约10与15之间。


9.如权利要求1-8中任一项所述的多孔基质，所述多孔基质的肌球蛋白-10丰度比在约10与15之间。


10.如权利要求1-9中任一项所述的多孔基质，其中所述基质被模制或修剪成尺寸适合于细胞培养孔的圆盘形状。


11.如权利要求1-10中任一项所述的多孔基质，所述多孔基质还包含至少一个接种的细胞的群体。


12.如权利要求1-11中任一项所述的多孔基质，所述多孔基质还包含至少一种治疗剂。


13.一种制备生物工程化的基质的方法，所述方法包括以下步骤：
将脱细胞的华通氏胶基质(DWJM)浸渍在液体介质中；
对浸渍的DWJM执行一个或多个均化循环以形成均化的DWJM，每个均化循环均包括均化期和休止期；
使所述均化的DWJM成形；
将所述均化的DWJM冷冻；以及
将冷冻的所述DWJM在真空下冻干以形...

【专利技术属性】
技术研发人员：奥马尔·阿利塔韦，哈尼·阿瓦德，迈克尔·贝克尔，
申请(专利权)人：罗切斯特大学，
类型：发明
国别省市：美国;US