一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法技术

本发明专利技术公开一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，包括如下步骤：以新鲜气管为原料，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h，随后置于含有0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton‑X 100的溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h，无菌蒸馏水洗涤后置于含2000kU/L Dnase‑Ⅰ和4000U/L RNase的1mol/L NaCl溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h，以溶解细胞核并降解DNA，以上操作均在‑0.96Bar的真空环境下进行，本研究采用真空辅助脱细胞方法能够促进DNA酶及RNA酶的渗透作用，加速并切底清除基质中细胞核物质及其他免疫原性成分，制备出无免疫原性的脱细胞细胞外基质，从而解决异体移植后免疫排异及严重炎症反应等并发症问题，同时，该方法还保留有适当的血管再生因子,有利于异体移植后诱导血管新生。

A vacuum assisted method for rapid preparation of acellular tracheal matrix in rabbits

【技术实现步骤摘要】
一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法
本专利技术涉及生物工程
，尤其是涉及一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法。
技术介绍
气管病损可由狭窄、软化、感染、创伤、肿瘤等引起。长段气管(超过成人50％或儿童30％)病变是外科手术的棘手难题，目前行之有效的办法是气管替代治疗。气管替代治疗始于上世纪，因替代物难以获取、微血管网再生障碍以及需要大量使用免疫抑制剂，使得种种研究均以失败告终。组织工程气管具有构建更新、再生与修复功能的活气管替代物的潜能。气管支架材料的结构及成分对种子细胞的黏附、生长、迁移以及组织功能重建起着至关重要的作用。细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)是组织工程重要组成部分，天然生物材料(如纤维蛋白、藻酸盐、同种异体脱细胞基质)具有较好的生物相容性、生物可降解性、以及可促进血管新生性能，是机体内细胞生长的微环境中最主要的成分，在调节细胞的生物学行为方面其重要作用。脱细胞ECM具有促进体内组织修复和再生功能，还可以指导和调节细胞(增殖和分化)反应，支持骨髓间充质干细胞(MSCs)向软骨细胞分化及上皮细胞的增殖，是细胞生长较为理想的环境。我们前期研究采用去污剂-联合酶法(detergentenzymaticmethod,DEM)脱细胞处理兔气管，能够有效去除气管抗原成分，保留与原生组织相似的主要结构特征，为细胞再生提供良好的微环境支持，但制备周期较长，需要9天时间，增加了体外操作污染风险。为进一步缩短脱细胞基质制备周期，我们采用真空脱细胞(vacuum-assisteddecellularization,VAD)方法制备组织工程气管天然ECM，有利于细胞黏附、生长，并能促进血管新生。VAD技术在不破坏气管ECM结构基础上，能够更有效清除DNA及MHC抗原物质。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，克服现有技术的不足。为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本专利技术是通过以下技术方案实现的：一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，包括如下操作步骤：步骤一：以新鲜气管为原料，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h；步骤二：将气管置于含有0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton-X100的溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h；步骤三：采用无菌蒸馏水洗涤气管后置于含2000kU/LDnase-Ⅰ和4000U/LRNase的1mol/LNaCl溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h。以上操作步骤均在-0.96Bar的真空环境下进行。本专利技术的有益效果是：1、本实验通过真空辅助脱细胞法，对新西兰兔气管进行脱细胞处理，通过组织学染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色和扫描电镜观察基质微观结构改变，DAPI染色、DNA定量分析、MHC-I/MHC-II免疫组化检测其免疫原性，鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)实验检测体内诱导血管新生性能，异体埋植术后HE染色、Masson三色染色、CD31免疫荧光、CD68免疫荧光评估基质的体内生物相容性、诱导血管新生性能及体内炎性反应，制备无免疫原性并具有诱导血管新生性能的脱细胞气管基质。本实验发现经过3天真空辅助脱细胞处理，可获取有与原生气管结构相似、无免疫原性、保留有诱导血管新生性能的兔脱细胞气管细胞外基质。与传统改良去污剂-联合酶法脱细胞处理相比，真空辅助脱细胞方法能够更加彻底清除细胞核物质及免疫原性成分，从而解决异体移植后免疫排异及严重的炎症反应等并发症问题，同时，该方法还保留有适当的血管再生因子(bFGF),有利于异体移植后诱导血管新生。2、本专利技术发现，经过为期3天的真空辅助脱细胞处理，可制备与原生气管相似结构的脱细胞基质，其黏膜上皮细胞及软骨细胞核物质被完全去除、组织结构完整、无免疫原性，并且保留有良好的细胞黏附及诱导血管新生性能，为制备天然气管脱细胞细胞外基质提供了有效的操作方法，并有望作为3D生物打印的生物墨水来源之一成为市场化商品，为实现利用脱细胞细胞外基质生物墨水构建3D生物打印气管移植物提供研究基础和希望。附图说明图1为各组组织病理切片染色结果。图2为MHC-I、MHC-II、b-FGF免疫组化染色结果。图3为DAPI、b-FGF、Col-II免疫荧光染色结果。图4为扫描电镜检查结果。图5为细胞核计数和DNA定量分析结果。图6为鸡胚绒毛尿囊膜实验结果。图7为各组基质在大鼠网膜埋植过程及术后大体标本观察结果。图8为术后2周HE染色及Masson三色染色结果。图9为术后2周CD31、CD68免疫荧光染色结果。图10为术后4周HE染色及Masson三色染色结果。图11为术后4周CD31、CD68免疫荧光染色结果。具体实施方式下面结合附图1-11对本专利技术的较佳实施例进行详细阐述，以使本专利技术的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本专利技术的保护范围做出更为清楚明确的界定。一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，其特征在于，包括如下操作步骤：步骤一：以新鲜气管为原料，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h；步骤二：将气管置于含有0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton-X100的溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h；步骤三：采用无菌蒸馏水洗涤气管后置于含2000kU/LDnase-Ⅰ和4000U/LRNase的1mol/LNaCl溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h。以上操作步骤均在-0.96Bar的真空环境下进行。下面结合具体实施方式对本专利技术进一步地详细说明。图1为各组组织病理切片染色结果，A、E、I表示原生组，B、F、J表示VAD8h组，C、G、K表示VAD16h组，D、H、L表示VAD24h组；其中，A-D为HE染色，E-H为Masson三色染色，I-L为番红O固绿染色(20×)；结果显示，经过真空脱细胞处理，组织细胞外基质结构保持完整。图2为MHC-I、MHC-II、b-FGF免疫组化染色结果，A-D为MHC-I免疫组化染色，E-H为MHC-II免疫组化染色，I-L为b-FGF免疫组化染色(20×)；结果显示，原生组、VAD8h组、VAD16h组有较为明显的MHC-I、MHC-II表达，而VAD24h组无MHC-I、MHC-II表达；但VAD24h组依然有少量b-FGF表达。图3为DAPI、b-FGF、Col-II免疫荧光染色结果，A-D为DAPI免疫荧光染色，E-H为b-FGF免疫荧光染色，I-L为Col-II免疫荧光染色(20×)；结果显示，VAD8h组、VAD16h组细胞核较原生组明显减少，但依然有所残留，VAD24h组细胞核近乎完全去除；不同组脱细胞处理的基质均匀明显的b-FGF、Col-II表达。图4为扫描电镜检查结果，A-D为立面观察本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，其特征在于，包括如下操作步骤：/n步骤一：以新鲜气管为原料，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h；/n步骤二：将气管置于含有0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton-X 100的溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h；/n步骤三：采用无菌蒸馏水洗涤气管后置于含2000kU/L Dnase-Ⅰ和4000U/L RNase的1mol/L NaCl溶液在37℃恒温摇床以60rpm转速孵育24h。/n以上操作步骤均在-0.96Bar的真空环境下进行。/n

【技术特征摘要】
1.一种真空辅助快速制备无免疫原性兔脱细胞气管基质方法，其特征在于，包括如下操作步骤：
步骤一：以新鲜气管为原料，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h；
步骤二：将气管置于含有0.25％脱氧胆酸钠和0.25％Triton-X100的溶液在37℃恒温摇...

【专利技术属性】
技术研发人员：史宏灿，孙飞，卢丹，王志豪，卢毅，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32