一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法及该方法的应用技术

本发明专利技术涉及生物分析检测技术领域，具体涉及一种测定O‑连接N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法及该方法的应用，本发明专利技术首先利用荧光基团对OGT的糖基受体进行修饰，通过OGT催化的酶反应将叠氮修饰的糖基转移至多肽上，再通过点击反应将糖受体连接到二苯并环辛炔修饰的大分子牛血清白蛋白上。利用牛血清白蛋白是大分子的性质，将其作为一个可以引起偏振信号增强的“FP tag”，从而直观的显示出OGT的酶活性。本发明专利技术解决了OGT对复杂修饰底物催化活力低的问题，同时实现了酶活力的高低与荧光偏振信号大小的关联，可用于测定OGT的酶活，也可以用于OGT的抑制剂的高通量筛选以及OGT抑制剂的抑制活性测定。

【技术实现步骤摘要】
一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法及该方法的应用
本专利技术涉及生物分析检测
，具体涉及一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法及该方法的应用。
技术介绍
O-连接N-乙酰氨基葡萄糖(O-linkedβ-N-acetylglucosamine,O-GlcNAc)糖基化是一种常见的蛋白翻译后修饰(Post-TranslationalModifications,PTMs)，是指的O-GlcNAc通过O-糖苷键连接到蛋白的丝氨酸和苏氨酸上的过程。真核细胞的细胞骨架蛋白、转录因子、表观遗传因子、激酶和磷酸酶等蛋白均存在不同程度的O-GlcNAc糖基化。此翻译后修饰在细胞的信号传导，转录翻译，基因表达，生长分化，免疫保护等过程中起着重要的作用。O-GlcNAc糖基化和磷酸化类似，是一种可逆的，动态的翻译后修饰，并且这两种翻译后修饰的修饰位点相同或者相邻，之间存在竞争关系。不同于磷酸化，调控O-GlcNAc糖基化水平的酶只有两个，O-GlcNAc转移酶(O-GlcNActransferase,OGT)和O-GlcNAc糖苷酶(O-GlcNAcase,OGA)。OGT催化糖供体UDP-GlcNAc将O-GlcNAc连接到受体蛋白上，而OGA则催化连在蛋白上的O-GlcNAc的水解。蛋白的O-GlcNAc糖基化和许多疾病的发生相关：(1)在2型糖尿病发生的过程中，胰岛素信号传导过程中关键蛋白的O-GlcNAc糖基化存在异常，但O-GlcNAc糖基化是否导致了2型糖尿病还没有定论。(2)神经元细胞中存在大量的O-GlcNAc糖基化修饰。O-GlcNAc糖基化对突触的形成(Synaptogenesis)，突触可塑性(SynapticPlasticity)起着的调控作用。神经退行性疾病病人的大脑蛋白质的O-GlcNAc糖基化水平显著降低，所以其可能在阿尔兹海默症形成过程中起着重要的作用。(3)肿瘤细胞对葡萄糖的需求大大增加，这导致了OGT过表达，而且原癌基因及抑癌基因所编码的蛋白质的O-GlcNAc糖基化水平也随之增加。研究表明，利用siRNA技术抑制乳腺癌小鼠体内的OGT表达，可以显著缩小小鼠的肿瘤，可见OGT是癌症治疗的一个潜在靶点。因此，强效、专一的OGT抑制剂是研究OGT糖基转移酶生物学功能的重要工具，也对研发O-GlcNAc糖基化相关疾病的药物具有重要的意义。目前，最常规的OGT活性测定方法是放射性糖供体法，即利用带放射性标记的糖供体UDP-[3H]-GlcNAc或者UDP-[14C]-GlcNAc进行测定。通过此方法，发现了OGT的第一个抑制剂：四氧嘧啶(Alloxan,IC50＝100μM)。同时，O-GlcNAc糖基化的副产物UDP(UridineDiphosphate，尿苷二磷酸)-GlcNAc对OGT也具有很好的抑制活性(IC50＝1.8μM)，后来许多UDP-GlcNAc的类似物也被合成出来，并且显示出了不错的OGT抑制活性。除了放射性糖供体法，近年来，也发展了其他一些测定OGT活性的方法，比如Azido-ELISA方法，Ni-NTA微孔板测定方法，Promega公司发展的基于生物发光的UDP-GLOTM方法等。此外，也可以利用液相色谱来监测OGT催化的反应。截至目前，可以高通量筛选OGT转移酶抑制剂的方法是基于荧光偏振(fluorescentpolarization,FP)的底物置换法(也称底物置换荧光偏振方法)。在溶液中，大分子例如蛋白质和酶，其转动通常比较缓慢，而酶的小分子底物和小分子荧光基团，在溶液中会进行快速的转动。当用偏振激发光照射连接着大分子的荧光基团时，由于其转动缓慢，其发射光将在其激发光的角度上保持很大的荧光强度，荧光偏振信号很强。但是小分子荧光基团在溶液中转动很快，所以使用偏振激发光照射小分子荧光基团时，其发射光在其激发光的角度上的荧光信号比较弱，荧光偏振信号很弱。基于FP的底物置换法正是利用此性质设计了基因荧光偏振的高通量筛选OGT转移酶的方法。此方法首先合成了OGT底物的的类似物，UDP-GlcNAc-fluorescein，其和OGT的活性位点具有一定的结合能力，故当UDP-GlcNAc-fluorescein和OGT混合时，fluorescein相当于通过非共价键连到了OGT大分子上，所以转动比较慢，具有较强的荧光偏振信号。当向溶液中加入OGT的抑制剂时，由于抑制剂和OGT活性位点之间具体更强的结合能力，UDP-GlcNAc-fluorescein和就会被抑制剂置换出来，溶液的荧光偏振信号减弱。利用此方法，发现了多个毫摩级别的抑制剂，之后通过药物化学的优化，得到了具有细胞渗透性的抑制剂OSMI-1，通过对OSMI-1进行进一步优化，得到了目前最强效的OGT抑制剂OSMI-4。虽然基于FP的底物置换法在OGT活性研究方面取得了一些突破，但是此方法需要大量的酶，且只能筛选出和UDP-GlcNAc存在竞争性关系的抑制剂，更重要的是此方法只能测定抑制剂和酶结合能力，而无法用于测定OGT的活性。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术提出了一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法，先利用糖基转移酶将荧光基团修饰的糖供体连接到糖受体上，再通过点击反应将糖受体(肽段)连接到二苯并环辛炔(DBCO)修饰的大分子牛血清白蛋白上，利用牛血清白蛋白是大分子的性质，将其作为一个可以引起偏振信号增强的“FPtag(FP标签)”，从而直观的显示出OGT的酶活性。此方法的优点是通量高，可以用于测定OGT的酶活力，也可以用于OGT抑制剂的高通量筛选以及OGT抑制剂的抑制活性测定。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：本专利技术提供一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法，即首先利用O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶将叠氮修饰的O-连接N-乙酰氨基葡萄糖的糖基供体连接到荧光基团修饰的O-连接N-乙酰氨基葡萄糖的糖受体上，再通过点击反应将糖受体连接到二苯并环辛炔修饰的大分子牛血清白蛋白上，最后根据荧光偏振信号的强弱判断O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的大小。本专利技术的“FPtag”方法(即OGT活性测定方法)在原理上不同于底物置换荧光偏振方法。“FPtag”方法是先利用糖基转移酶(Glycosyltransferases,GTs；本专利技术所使用的GTs是OGT)将叠氮修饰的糖基供体连接到荧光基团修饰的糖受体上，再通过点击反应将糖受体(肽段)连接到二苯并环辛炔(DBCO)修饰的大分子牛血清白蛋白(BovineSerumAlbumin，BSA)上。此过程相当于把和糖受体相连的荧光基团，通过共价键连接到了大分子上，从而产生了比较强的荧光偏振信号的变化。也就是说本专利技术是利用牛血清白蛋白是大分子的性质(66kDa)，将其作为一个可以引起偏振信号增强的“FPtag”，从而直观的显示出OGT的酶活性，既可以用于测定OGT的酶活力，也可以用于OGT抑制剂的高通量筛选以及OGT抑制剂的抑制活性测定。而底物置换荧光偏振方法是通过UDP-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法，其特征在于，首先利用O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶将叠氮修饰的O-连接N-乙酰氨基葡萄糖的糖基供体连接到荧光基团修饰的O-连接N-乙酰氨基葡萄糖的糖受体上，再通过点击反应将糖受体连接到二苯并环辛炔修饰的大分子牛血清白蛋白上，最后根据荧光偏振信号的强弱判断O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的大小。/n

【技术特征摘要】
1.一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法，其特征在于，首先利用O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶将叠氮修饰的O-连接N-乙酰氨基葡萄糖的糖基供体连接到荧光基团修饰的O-连接N-乙酰氨基葡萄糖的糖受体上，再通过点击反应将糖受体连接到二苯并环辛炔修饰的大分子牛血清白蛋白上，最后根据荧光偏振信号的强弱判断O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的大小。


2.根据权利要求1所述的一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、配置OGT酶反应体系：包括FAM-CKII肽段、UDP-GlcNAcN3、ncOGT酶蛋白和缓冲液。
S2、将步骤S1的反应体系避光孵育一段时间后，终止反应；
S3、将牛血清白蛋白与二苯并环辛炔-活性脂混合，孵育一段时间后生成DBCO-BSA复合物；
S4、将步骤S2终止反应后的酶反应体系用磷酸盐缓冲液稀释至合适的浓度，加入步骤S3的DBCO-BSA复合物进行点击反应；
S5、点击反应结束后，用酶标仪检测荧光偏振信号，并读取荧光偏振信号值。


3.根据权利要求2所述的一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法，其特征在于，所述FAM-CKII肽段具有如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。


4.根据权利要求2所述的一种测定O-连接N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的方法，其特征在于，所述缓冲液包括NaCl...

【专利技术属性】
技术研发人员：高志增，尹新坚，李佳欣，刘岚，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44