一种HPV样品采集保存卡及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种HPV核酸（DNA/RNA）样本采集保存卡，具体涉及一种HPV样品采集保存卡及其制备方法。相较于传统的核酸保存卡，本发明专利技术的保存卡制备过程中使用的浸泡液中完全不需要使用EDTA、SDS和尿酸等PCR抑制剂成分，这不仅大大降低了HPV保存卡的生产成本，而且其添加成分也不会对PCR结果产生任何影响，在后续病毒核酸检测中无需进行繁琐的核酸提取纯化操作步骤；同时，在HPV样品保存中却能取得与传统保存卡相当（甚至更优）的保存效果。

【技术实现步骤摘要】
一种HPV样品采集保存卡及其制备方法
本专利技术涉及一种核酸（DNA/RNA）样本采集保存卡，特别涉及一种HPV样品采集保存卡及其制备方法，属于医疗设备

技术介绍
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤。原位癌高发年龄为30～35岁，浸润癌为45～55岁，近年来其发病有年轻化的趋势。宫颈癌在全球妇女的癌症死因中高居第二位，仅次于乳腺癌。国内外学者就HPV感染与子宫颈癌的关系进行了大量的研究，并获取了许多实验室与临床证据。1977年Laverty在电镜中观察到子宫颈癌活检组织中存在HPV颗粒，1981年第一次在生殖道分离出了HPV，1983-1986年依次从宫颈癌样本中分离出HPV16、18、31、35等类型。1995年IARC专题讨论会确定：HPV感染是子宫颈癌的主要病因。目前研究发现99.7％的宫颈鳞状细胞癌有人乳头瘤病毒的感染，而高危型人乳头状瘤病毒的持续感染是宫颈癌发病的重要因素。人乳头瘤病毒（HumanPapillomaviruses，HPV）属于乳多空病毒科的乳头瘤空泡病毒A属，是球形DNA病毒，外形呈20多面体对称型，无包膜，直径约45nm～55nm，基因组为共价闭合环状双链DNA分子，含近8000个碱基对（bp）。HPV能引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，表现为寻常疣、生殖器疣（尖锐湿疣）等症状。女性一生中有80%的几率会感染HPV，并可能会反复感染，通常感染在8-10个月内被自然清除，只有少数（5%）妇女呈持续感染状态。按照HPV亚型与癌症相关性的高低将HPV分为高危型和低危型。高危型HPV包括HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82；可能的高危型包括HPV26、53和66；低危型包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81和CP6108。HPV感染的检测和分型对了解女性生殖道肿瘤相关病情、判断预后、指导治疗、分析HPV流行状况以及基因疫苗的研制均具有重要价值。定期的HPV检测被权威指南推荐为可用于早期发现宫颈癌风险的初筛手段之一，越来越多的HPV分析检测方法被开发出来，包括细胞学检测、血清学检测、基因检测，其中，基因检测由于其检测结果准确以及检测的高敏感性和特异性，广泛应用于临床的大面积筛查。传统的HPV基因检测大多是基于医生取样，覆盖率受医疗资源的限制，尤其是偏远落后地区。随着检测技术的进步，新兴技术层出不穷，自取样技术在2017年被美国克利夫兰医学中心评为全球十大医学创新技术之一。自取样HPV检测，受检者自己在家就能够进行取样，然后寄送样本到实验室检查，不用经过长途跋涉到医院进行长时间的排队检查。在第五届全国阴道镜与宫颈病理学（CSCCP）大会自取样专题会上，自取样HPV检测因具有不受时间地域限制、易于操作的优势受到了许多专家学者的肯定。基于HPV自检测技术的高敏感性、高阴性预测值及客观性，HPV自检测已经成为宫颈癌筛查的主要方法之一。HPV自检测应用首先涉及HPV样品检材的采集，之后将生物HPV样品运输至检测实验室进行核酸提取及检测。在这一系列的操作中面临的最主要的问题是如何有效保存待检样品中的核酸不被降解，同时灭活样品中的HPV等病原微生物，以确保操作者及大众的安全。目前国内外使用最广泛的生物样品的保存方法是将采集样品保存至各类保存卡上，而商品化保存卡主要是英国Whatman公司的FTA系列保存卡。FTA保存卡包含一种包埋在过滤基质中的特殊干燥化学试剂混合物，该混合物包括蛋白质变性剂、一种螯合剂和一种自由基捕捉剂，它对人无毒，用FTA技术收集的核酸可以在室温下和高湿度环境下保存多年而不降解。细胞样品在接触FTA时会裂解掉，而其中的核酸则被固定下来，FTA是目前唯一的在实验室外收集样品的遗传分析工具。近期国内一些企业也纷纷致力于国产核酸采集卡的研制，其基本核心技术都同FTA技术类似。但FTA及其国内类似产品价格昂贵，且其设计的初衷主要是解决样本保存和运输中的问题，后续检测是以核酸分离提取为前提，样本在实施PCR等核酸检测之前需要分离步骤以除去样本卡中的去垢剂等裂解试剂，这增加了实验操作步骤和样本受到污染的几率；且为了保证产品的普适性，FTA及其类似仿制品均需要同时兼顾对组织、细胞、病毒等多种样品的裂解和保存，但是对某一单类样品的应用存在一定缺陷；尤其对HPV样品来说，其取样于女性宫颈部位，很多样品存在支原体等特殊微生物。此外，不管FTA保存卡还是其他仿制品，其保存液中大多含有SDS、EDTA等试剂，如果保存的样本不经过核酸提取步骤，保存液中的SDS、EDTA等试剂将严重影响PCR结果的准确度和灵敏度。因此，为了在HPV自取样检测中实现更高的检测精度和检测敏感度，有必要针对HPV病毒定制一套专门适用于病毒样本的HPV自采样试剂体系，以增加对HPV病毒样本的高效特异裂解和保存，并能有效抑制其他微生物生长，同时不会对后续免核酸提取的直扩PCR检测灵敏度产生影响的保存卡及其制备方法。
技术实现思路
为解决当前保存卡存在的问题，本专利技术提供一种专门用于HPV样品保存的核酸保存卡，本专利技术的保存卡不仅可以有效抑制宫颈样品其他微生物，而且不需要使用能够影响PCR检测准确度和灵敏度的试剂，保存的样本可直接用于下游核酸分子检测，无需进行核酸分离提取步骤。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：本专利技术提供一种专有的HPV保存卡浸泡液，其配方为：细胞裂解剂、核酸稳定剂、颜色指示剂和水，pH值为9.5-11.5。本专利技术的保存卡可有效灭活有潜在传染性的细菌、真菌、病毒和其它微生物，并有效裂解细胞、释放样品中DNA，保护样品DNA免受核酸酶降解，并用颜色指示保存卡中样本的存在。优选地，本专利技术的细胞裂解液选用蛋白质变性剂异硫氰酸胍或盐酸胍中的一种或两种，能够迅速破碎细胞或病毒释放核酸，并且能够抑制细胞释放出来的核酸酶的活性，保证核酸一级结构的完整性。胍盐是破坏蛋白质三维结构的离液剂，能迅速溶解蛋白质，导致核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。在通常使用的蛋白质变性剂中作用最强的是异硫氰酸胍，含有强力的阴离子和阳离子基团，形成较强的氢键，可以使多数蛋白质转换成一随机的卷曲状态。在还原剂存在的情况下，异硫氰酸胍可以断裂氢键，而在去垢剂如SDS存在的情况下，可以破坏疏水作用。在具体实施例中，本专利技术所述HPV卡中的细胞裂解剂优选采用浓度范围1M-4M的异硫氰酸胍，能够裂解细胞同时抑制核酸酶和病原菌活性。本专利技术的核酸稳定剂为有机缓冲溶液和/或无机缓冲溶液，其中有机溶液可以为Tris、乙醇胺、三乙醇胺、甘氨酸或柠檬酸三钠等，无机溶液可以为碳酸盐、碳酸氢盐、磷酸盐或硼酸盐。在具体实施例中，优选地，本专利技术所述HPV保存卡中优选采用的核酸稳定剂为50mM-100mM的Tris缓冲液，可以提供足够的缓冲环境，维持核酸磷酸基团与纤维膜的带电状态，利于氢键的保持，有利于DNA维持构象，对DNA碱基起保护作用，不易破坏其完整性或产生断裂，可使核酸保持稳定，避免脱氨基的发生。本专利技术的颜色指示剂可为有本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HPV保存卡浸泡液，其特征在于：所述浸泡液由细胞裂解剂、核酸稳定剂、颜色指示剂、牛磺酸盐和水组成，其pH值为9.5-11.5；其中，所述细胞裂解液为异硫氰酸胍，所述核酸稳定剂为Tris，所述颜色指示剂为溴酚蓝，所述水为无核酸酶水。/n

【技术特征摘要】
1.一种HPV保存卡浸泡液，其特征在于：所述浸泡液由细胞裂解剂、核酸稳定剂、颜色指示剂、牛磺酸盐和水组成，其pH值为9.5-11.5；其中，所述细胞裂解液为异硫氰酸胍，所述核酸稳定剂为Tris，所述颜色指示剂为溴酚蓝，所述水为无核酸酶水。


2.根据权利要求1所述的浸泡液，其特征在于：所述牛磺酸盐为牛磺酸钠。


3.权利要求1-2任一项所述的浸泡液，其特征在于：所述Tris的浓度为50mM-100mM，所述异硫氰酸胍的浓度为1M-4M，所述溴酚蓝的浓度为0.01~0.05%，所述牛磺酸盐的浓度为0.5-1M。


4.一种HPV保存卡，其特征在于，所述保存卡按照如下方法制备：
（1）配制权利要求1-3任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：殷剑峰，刘淑君，王春香，
申请(专利权)人：北京健为医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11