一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法技术

本申请公开了公开了一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，包括以下步骤：步骤一、将待测细胞裂解后离心，分离得到含有端粒酶的上清液；步骤二、将含有端粒酶的上清液与端粒酶底物混合，生成端粒酶延长产物；步骤三、端粒酶底物延长反应完成后，进行扩增反应，最终形成荧光检测信号；步骤四、利用荧光仪检测荧光信号的强度。本发明专利技术实施例提供的通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，利用具有链置换活性的DNA聚合酶的延伸反应与核酸切口酶识别并切割特定双链中单链的性质，在等温条件下可以对寡核苷酸单链迅速扩增。该反应不仅具有较高的扩增效率，能够实时、快速检测，同时不需要精确的热循环设备。

【技术实现步骤摘要】
一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法
本申请涉及端粒酶活性检测领域，具体涉及一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法。
技术介绍
端粒酶(Telomerase)是一种核蛋白逆转录酶，由RNA模板和蛋白催化亚基组成。通过反转录作用，它可以延伸染色体端粒的3′末端的重复序列(TTAGGG)n，从而实现稳定端粒长度，抑制细胞分裂的作用。在正常人体组织和细胞中，端粒酶的活性被抑制，而在超过85％的已知肿瘤细胞中，端粒酶往往具有较高的活性，被认为与肿瘤细胞的激活，转化增殖等过程密切相关。在临床诊断领域，端粒酶是一种重要的恶性肿瘤标志物。此外，许多癌症治疗方法和药物也以抑制肿瘤细胞中端粒酶活性为目标，因此，建立高灵敏度、选择性强、操作简便的端粒酶活性检测方法，对于癌症的早期诊断及治疗具有十分重要的意义。目前，对于肿瘤细胞中的端粒酶检测主要是通过在kim等建立的端粒酶重复序列扩增法(Telomericrepeatamplificationprotocol，TRAP)基础上建立起来的一系列改良方法，包括TRAP结合EB染色法，TRAP结合银染色法，实时荧光TRAP法等。该类方法的核心在于利用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增被端粒酶延长的底物(TelomeraseSubstrate，TS)，实现检测信号的放大，通过PCR产物来表征端粒酶的逆转录活性。虽然TRAP类方法具有较高的灵敏度，但操作复杂，反应步骤多，耗时长，需要配备价格昂贵的热循环设备；此外，PCR技术中Taq聚合酶的活性容易受到复杂体系的抑制，产生假阴性结果，而引物二聚体又容易引起假阳性信号，对端粒酶的检测形成严重的干扰。因此TRAP类方法不适用于临床肿瘤细胞端粒酶的实时、快速检测。因此提供一种实时、快速检测端粒酶活性的方法，成为人们亟待解决的问题。
技术实现思路
本申请的主要目的在于提供一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，以解决现有技术中检测方法不适用于端粒酶的实时、快速检测的问题。为了实现上述目的，本专利技术实施例提供如下技术方案：根据本专利技术实施例的第一方面，提供一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，包括以下步骤：步骤一、将待测细胞裂解后离心，分离得到含有端粒酶的上清液；步骤二、将含有端粒酶的上清液与端粒酶底物混合，在端粒酶逆转录缓冲液中利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物，生成端粒酶延长产物；步骤三、端粒酶底物延长反应完成后，加入探针、血清蛋白碱基、作为底物的dNTPs、以及信号转化分子，进行扩增反应，最终形成的二级扩增产物与信号转化分子作用产生放大的荧光检测信号；步骤四、利用荧光仪检测荧光信号的强度，根据荧光信号的检测结果与细胞数量来绘制标准曲线，根据标准曲线反映的线性关系判断待测细胞中端粒酶的活性。进一步的，步骤一中将待测细胞裂解的方法包括反复冻融法、酶解法、机械方法中的任意一种或两种以上的组合。进一步的，步骤一中将待测细胞裂解的方法为超声波处理法，超声波处理频率为2kHz，超声波间隔时间3s。进一步的，所述的端粒酶逆转录缓冲液包括20mMTris-HC1、1.5mMMgCl2、1mMEGTA、63mMKCl、0.2mMdNTPs和体积分数为0.05％的Tween20。进一步的，所述的端粒酶逆转录缓冲液的pH值为6-8。进一步的，所述端粒酶底物的浓度为120-140nM，反应温度26-30℃，反应时间为1-1.2h。进一步的，血清蛋白碱基的获取方法包括以下步骤：步骤一、血细胞与血清分离:将血液放入离心机中处理，沉淀为血细胞，上部为血清；步骤二、乳糜粒分离:将血清放入离心机中处理，离心管下部3/4容积加血浆，上部1/4容积加0.5MnaCl+0.3MEDTA，ph7.6；步骤三、血清蛋白分离:除去球蛋白，白蛋白及其它蛋白质；管容量1/3为血清，2/3为1.31g/ml,NaCl+NaBr,搅拌后终密度为1.21g/ml，管上部1/6容积为血清脂蛋白，下部5/6为其它蛋白。进一步的，步骤二中离心机的离心参数为4×10(g×min)，离心处理温度为9-11℃。进一步的，步骤三中离心参数:(2.5-3)×10(g×hr)，离心处理温度为9-11℃。根据本专利技术实施例的第二方面，提供一种端粒酶活性检测试剂盒的使用方法，包括任一项所述通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法。本专利技术实施例具有如下优点：本专利技术实施例提供一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，利用具有链置换活性的DNA聚合酶的延伸反应与核酸切口酶(nickingenzyme)识别并切割特定双链中单链的性质，在等温条件下可以对寡核苷酸单链迅速扩增。该反应其不仅具有较高的扩增效率，能够实时、快速检测，同时不需要精确的热循环设备；此外具有链置换活性的DNA聚合酶，如KF聚合酶(KlenowFragmentpolymerase)等相对于TaqDNA聚合酶受复杂体系影响较小。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本申请方案，下面将结合案例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。实施例1本实施例提供一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，包括以下步骤：步骤一、将待测细胞裂解后离心，分离得到含有端粒酶的上清液；步骤二、将含有端粒酶的上清液与端粒酶底物混合，在端粒酶逆转录缓冲液中利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物，生成端粒酶延长产物；步骤三、端粒酶底物延长反应完成后，加入探针、血清蛋白碱基、作为底物的dNTPs、以及信号转化分子，进行扩增反应，最终形成的二级扩增产物与信号转化分子作用产生放大的荧光检测信号；步骤四、利用荧光仪检测荧光信号的强度，根据荧光信号的检测结果与细胞数量来绘制标准曲线，根据标准曲线反映的线性关系判断待测细胞中端粒酶的活性。优选的，步骤一中将待测细胞裂解的方法包括反复冻融法、酶解法、机械方法中的任意一种或两种以上的组合。优选的，步骤一中将待测细胞裂解的方法为超声波处理法，超声波处理频率为2kHz，超声波间隔时间3s。优选的，所述的端粒酶逆转录缓冲液包括20mMTris-HC1、1.5mMMgCl2、1mMEGTA、63mMKCl、0.2mMdNTPs和体积分数为0.05％的Tween20。优选的，所述的端粒酶逆转录缓冲液的pH值为6-8。优选的，所述端粒酶底物的浓度为120-140nM，反应温度26-30℃，反应时间为1-1.2h。优选的，血清蛋白碱基的获取方法包括以下步骤：步骤一、血细胞与血清分离:将血液放入离心机中处理，沉淀为血细胞，上部为血清；步骤二、乳糜粒分离:将血清放入离心机中处本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤一、将待测细胞裂解后离心，分离得到含有端粒酶的上清液；/n步骤二、将含有端粒酶的上清液与端粒酶底物混合，在端粒酶逆转录缓冲液中利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物，生成端粒酶延长产物；/n步骤三、端粒酶底物延长反应完成后，加入探针、血清蛋白碱基、作为底物的dNTPs、以及信号转化分子，进行扩增反应，最终形成的二级扩增产物与信号转化分子作用产生放大的荧光检测信号；/n步骤四、利用荧光仪检测荧光信号的强度，根据荧光信号的检测结果与细胞数量来绘制标准曲线，根据标准曲线反映的线性关系判断待测细胞中端粒酶的活性。/n

【技术特征摘要】
1.一种通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将待测细胞裂解后离心，分离得到含有端粒酶的上清液；
步骤二、将含有端粒酶的上清液与端粒酶底物混合，在端粒酶逆转录缓冲液中利用端粒酶的逆转录活性延长端粒酶底物，生成端粒酶延长产物；
步骤三、端粒酶底物延长反应完成后，加入探针、血清蛋白碱基、作为底物的dNTPs、以及信号转化分子，进行扩增反应，最终形成的二级扩增产物与信号转化分子作用产生放大的荧光检测信号；
步骤四、利用荧光仪检测荧光信号的强度，根据荧光信号的检测结果与细胞数量来绘制标准曲线，根据标准曲线反映的线性关系判断待测细胞中端粒酶的活性。


2.根据权利要求1所述通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，其特征在于：步骤一中将待测细胞裂解的方法包括反复冻融法、酶解法、机械方法中的任意一种或两种以上的组合。


3.根据权利要求2所述通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，其特征在于：步骤一中将待测细胞裂解的方法为超声波处理法，超声波处理频率为2kHz，超声波间隔时间3s。


4.根据权利要求1所述通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶活性的方法，其特征在于：所述的端粒酶逆转录缓冲液包括20mMTris-HC1、1.5mMMgCl2、1mMEGTA、63mMKCl、0.2mMdNTPs和体积分数为0.05％的Tween20。


5.根据权利要求4所述通过血清蛋白碱基影响基因端粒酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜剑波，
申请(专利权)人：上海完形健康管理咨询有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31