NK细胞无血清培养液及NK细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及一种NK细胞无血清培养液及NK细胞的培养方法，该无血清培养液包括基础培养液、促生长组分、酶抑制剂、微量元素和微支撑体，在该培养液中不含牛血清白蛋白，在培养NK细胞之后，纯化过程简单，并且避免动物蛋白引起人体免疫反应；同时在无血清培养液中具有微支撑体，且具有促进贴壁生长的昆布氨酸和多聚赖氨酸，能够提高NK细胞的扩增速度；在培养基中加入微量元素锌能够提高抗体表达量，也可以抑制细胞的凋亡；铜也可以提高抗体表达量。本发明专利技术的培养液能够实现对NK细胞培养的高效培养，并且能够提高NK细胞对肿瘤的杀伤能力。

【技术实现步骤摘要】
NK细胞无血清培养液及NK细胞的培养方法
本专利技术涉及细胞生物学
，特别涉及一种NK细胞的无血清培养液，及采用该无血清培养液对NK细胞的培养方法。
技术介绍
NK细胞又称自然杀伤细胞(naturalkillercell，NK细胞)，是机体内重要的免疫细胞，作为与T细胞、B细胞并列的一大类淋巴细胞群体，是天然免疫系统的重要成员，负责杀伤老化、受病毒感染、肿瘤等异常细胞。肿瘤是困扰人类健康的重大疾病，但由于其高度的复杂性、多样性、可变性和异质性，一直找不到一种更加深入治疗方法，随着医学的进步，癌症的治愈率、生存率都有显著的改善，但现在仍然是难治性的疾病。NK细胞的靶细胞主要是肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞(如血细胞)及寄生虫等，因此NK细胞是机体抗肿瘤、抗感染免疫的重要组成部分。由于这些特点，NK细胞在细胞免疫治疗上有着广泛的应用前景。在体外被活化的NK细胞毒性较高，可用作免疫细胞的治疗制剂。人体体外及动物试验证实了其对各种癌症治疗的可能性：利用肿瘤细胞系的方法，确认其对血液系统肿瘤(白血病和淋巴瘤等)、肝癌、肺癌、肾癌、神经系统肿瘤和皮肤癌等均具有体外细胞毒性，特别是对白血病和神经源性肿瘤已明确了其临床及非临床的治疗效果。2009年，NK细胞治疗技术就已列入国家三类医疗技术目录。充足的细胞数量和强烈的细胞毒性是细胞治疗疗效提升的关键因素。现有的细胞免疫治疗中的NK细胞主要是通过分离血液中的淋巴细胞，经体外培养、各种细胞因子刺激诱导扩增培养，得到一定量的细胞后回输人体，进行肿瘤治疗。现有NK细胞的培养基主要是由基础培养基、动物血清和各种因子培养组成，培养得到的NK细胞增殖倍数有限、数量不多，不能广泛的用于治疗，限制了NK细胞在免疫细胞治疗中的应用。对于现有的NK细胞培养基中，由于添加了动物血清（通常为牛血清白蛋白），这种含有内源性免疫球蛋白的产品不但质量难以控制并标准化，而且还蕴藏着若干不安全因素，并且在使用培养液培养NK细胞之后，在应用于人体之前，纯化过程太复杂且效果不是太好；同时，前国内开发的大多数无血清培养基都能够支持细胞生长，但大多是在已有培养基如DMEM、DMEM/F12等基础上加入各种营养物质，成分复杂，产品的质量和安全性面临考验，同时也为下游纯化带来了困难。而国外Life、Thermo、Lonza等公司的无血清培养基虽然质量可靠稳定，不含蛋白，但其价格相对较为昂贵，成分秘而不宣，不仅增加了细胞大规模培养的成本，减小了产能提升和成本降低的空间，而且不利于根据产品需要对培养基进行优化调整，大大减少了后续的优化空间。在NK细胞培养过程中面临的另一个问题就是NK细胞增殖速度过缓，虽然现有技术中提出了可以采用立体增殖的模式，但并没有关注在立体增殖过程中，由于NK细胞最初的增殖速度过快会对某种营养成分消耗过快，如果不及时补充消耗过快的营养物质，则后续生长速度会变缓慢；同时，在立体增殖时，也没有考虑到加入的添加剂是否具有很好的生物相容性，生物相容性较差时会对NK细胞的增殖过程造成污染。而在培养NK细胞时，还需要兼顾NK细胞的细胞杀伤活性，而现有的无血清的培养液并没有兼顾细胞杀伤活性，导致培养的细胞杀伤活性较差。
技术实现思路
针对现有技术中的细胞培养液具有的成分上的缺陷，使培养的NK细胞具有安全隐患，且对后续的纯化过程要求极高；使用的培养液培养的NK细胞速度缓慢且杀伤活性较差的缺点，提出了本专利技术的技术方案。有鉴于此，本专利技术所解决的技术问题是提供一种不含牛血清白蛋白的NK细胞培养液，在使用该培养液培养NK细胞之后，在应用于人体之前，纯化过程不会太复杂，避免了动物蛋白引起的人体免疫反应的风险；并且该培养液为能够使NK细胞快速增殖的无血清培养液，并且能够提高NK细胞的杀伤活性。并且也提供了一种使用NK无血清培养液高速培养NK细胞的方法。为解决现有技术的缺陷并得到上述技术效果，提供如下的具体方案：本专利技术的提供的一种用于培养NK细胞的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述无血清培养液包括基础培养液、促生长组分、酶抑制剂、微量元素和微支撑体，所述基础培养液包括：转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、精氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸；所述促生长组分包括有单克隆抗体、白细胞介素、昆布氨酸和多聚赖氨酸；所述酶抑制剂为吲哚美辛和胰酶抑制剂或塞来昔布和胰酶抑制剂；所述微量元素包括有含锌、铜、钠、钾、钙、镁、铁的无机盐物质；所述微支撑体包括聚乳酸和/或壳聚糖。更进一步的，所述基础培养液还包括有葡萄糖、生物素、维生素B12、叶酸。更进一步的，转铁蛋白的浓度为10-30mg/L、胰岛素的浓度为10-35mg/L、谷氨酰胺的浓度为14-25mmol/L，丙酮酸钠的浓度为3-10mmol/L、精氨酸的浓度为280-315mg/L、谷氨酸的浓度为20-23mg/L、羟脯氨酸的浓度为4-15mg/L、异亮氨酸的浓度为35-55mg/L、脯氨酸的浓度为25-40mg/L、丝氨酸的浓度为15-35mg/L、色氨酸的浓度为6-15mg/L。更进一步的，所述葡萄糖的浓度为1500-4000mg/L、生物素的浓度为0.3-0.8mg/L、维生素B12的浓度为0.01-0.05mg/L、叶酸的浓度为4-6mg/L。更进一步的，所述单克隆抗体浓度为20-80μg/L、白细胞介素浓度为30-180μg/L、昆布氨酸浓度为40-500μg/L，多聚赖氨酸的浓度为300-800μg/L。更进一步的，所述吲哚美辛或塞来昔布的浓度为30-80μmol/L，所述胰酶抑制剂的浓度40-100μmol/L。更进一步的，还包括pH调节剂，所述培养基的pH值为6.9-7.3，渗透压为160-280mOsm/kg。更进一步的，所述微支撑体的含量为0.5-2.5g/L。更进一步的，所述微量元素含锌的无机盐物质为氯化锌，其浓度为1-50mg/L；所述含铜的无机盐为硫酸铜，其浓度为3-35mg/L。更进一步的，所述含钠的无机盐物质为氯化钠，其浓度为2000-6500mg/L；含钾的无机盐物质为氯化钾，其浓度为100-400mg/L；含钙的无机盐物质为氯化钙，其浓度为250-400mg/L；含镁的无机盐物质为氯化镁，其浓度为20-100mg/L；含铁的无机盐物质为硝酸铁，其浓度为30-80mg/L。同时，本专利技术也提供一种使用NK细胞无血清培养液对NK细胞的培养方法，其特征在于，所述NK细胞无血清培养液如前所述的NK细胞无血清培养液，所述培养方法包括如下步骤：步骤1：获取原始NK细胞；步骤2：将所述NK细胞置于上述无血清培养液中；步骤3：在所述无血清培养液中加入人CD3抗体活化剂，刺激NK细胞增殖；步骤4：对刺激诱导后的NK细胞进行扩增培养，获得NK细胞。更进一步的，在步骤4之后还包括NK细胞收集：培养的第10-21天，离心收集NK细胞。更进一步的，培养NK细胞的培养温度为37℃，CO本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种NK细胞无血清培养液，所述NK细胞无血清培养液用于培养NK细胞，其特征在于，所述无血清培养液包括基础培养液、促生长组分、酶抑制剂、微量元素和微支撑体，所述基础培养液包括：转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、精氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸；所述促生长组分包括有单克隆抗体、白细胞介素、昆布氨酸和多聚赖氨酸；所述酶抑制剂包括吲哚美辛和胰酶抑制剂或塞来昔布和胰酶抑制剂；所述微量元素包括有含锌、铜、钠、钾、钙、镁、铁的无机盐物质；所述微支撑体包括聚乳酸和/或壳聚糖。/n

【技术特征摘要】
1.一种NK细胞无血清培养液，所述NK细胞无血清培养液用于培养NK细胞，其特征在于，所述无血清培养液包括基础培养液、促生长组分、酶抑制剂、微量元素和微支撑体，所述基础培养液包括：转铁蛋白、胰岛素、谷氨酰胺、丙酮酸钠、精氨酸、谷氨酸、羟脯氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、丝氨酸、色氨酸；所述促生长组分包括有单克隆抗体、白细胞介素、昆布氨酸和多聚赖氨酸；所述酶抑制剂包括吲哚美辛和胰酶抑制剂或塞来昔布和胰酶抑制剂；所述微量元素包括有含锌、铜、钠、钾、钙、镁、铁的无机盐物质；所述微支撑体包括聚乳酸和/或壳聚糖。


2.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述基础培养液还包括有葡萄糖、生物素、维生素B12、叶酸。


3.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述转铁蛋白的浓度为10-30mg/L、所述胰岛素的浓度为10-35mg/L、所述谷氨酰胺的浓度为14-25mmol/L，所述丙酮酸钠的浓度为3-10mmol/L、所述精氨酸的浓度为280-315mg/L、所述谷氨酸的浓度为20-23mg/L、所述羟脯氨酸的浓度为4-15mg/L、所述异亮氨酸的浓度为35-55mg/L、所述脯氨酸的浓度为25-40mg/L、所述丝氨酸的浓度为15-35mg/L、所述色氨酸的浓度为6-15mg/L。


4.如权利要求2所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述葡萄糖的浓度为1500-4000mg/L、所述生物素的浓度为0.3-0.8mg/L、所述维生素B12的浓度为0.01-0.05mg/L、所述叶酸的浓度为4-6mg/L。


5.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述单克隆抗体浓度为20-80μg/L、白细胞介素浓度为30-180μg/L、昆布氨酸浓度为40-500μg/L，多聚赖氨酸的浓度为300-800μg/L。


6.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述吲哚美辛或塞来昔布的浓度为30-80μmol/L，所述胰酶抑制剂的浓度40-100μmol/L。


7.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，还包括pH调节剂，所述基础培养基的pH值为6.9-7.3，渗透压为160-280mOsm/kg。


8.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其特征在于，所述微支撑体的含量为0.5-2.5g/L。


9.如权利要求1所述的NK细胞无血清培养液，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔兴日，吴俊昌，陈业祖，孙晓，
申请(专利权)人：深圳市一五零生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44