基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法技术

本发明专利技术涉及一种基于视网膜组织/类器官‑视网膜组织制备单细胞悬液的方法。本发明专利技术选用视网膜组织或类器官‑视网膜组织，并筛选出高效两种消化酶及其使用剂量和浓度、使用比例和酶的作用时间等，确保视网膜单细胞悬液内各类细胞的高活性率（存活率≥90%以上，符合细胞建库要求）、低结团率和低死细胞率；本发明专利技术方法操作简便、耗时短，可为视网膜单细胞RNA‑Sequence测序和ATCT‑Sequence测序等提供高效的活细胞；进而对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，揭示视网膜发育过程中不同细胞群体的转录因子变化规律，揭示细胞命运转变过程中各类细胞转录组的变化规律。

A method of preparing single cell suspension based on retina tissue / organ like tissue retina

The invention relates to a method for preparing single cell suspension based on retinal tissue / organ like / retinal tissue. The present invention selects retinal tissue or organ like retinal tissue, selects two high-efficiency digestive enzymes and their dosage and concentration, proportion and action time of enzyme, so as to ensure high activity rate (survival rate \u2265 90%, meeting the requirements of cell database construction), low aggregation rate and low dead cell rate of all kinds of cells in retinal single cell suspension; the method of the invention is simple and cost-effective Short time can provide efficient living cells for RNA \uffe3 sequence sequencing and ATCT \uffe3 sequence sequencing of retinal single cells; then, bioinformatics analysis and mining of high-throughput data obtained by sequencing can reveal the transcriptional factors change rules of different cell populations in the process of retinal development, and reveal the change rules of transcriptome of various cells in the process of cell fate transformation.

【技术实现步骤摘要】
基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法
本专利技术涉及眼科试验
，具体涉及一种基于视网膜组织/类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法。
技术介绍
世界卫生组织三个大样本的流行病学调查显示，致盲性眼病已成为继肿瘤、心血管疾病之后的第三位影响人们生存质量的疾病。由于遗传缺陷、衰老或代谢等因素，导致以视网膜感光细胞变性为特征的视网膜变性疾病，是造成不可逆性失明的最主要原因。视网膜变性疾病是一类严重的致盲性疾病,最主要分为视网膜色素变性(retinitispigmentosa,RP)和年龄相关性黄斑变性(agerelatedmaculardegeneration,AMD)。遗传性RP多发于少年和青壮年，患者在青壮年时期双眼失明，国内发病率为0.3%；AMD常见于中老年人，且随年龄增加，发病率逐年升高，成为老年致盲的主要疾病。我国每年因视网膜遗传缺陷、衰老或代谢疾病导致以视网膜感光细胞变性为特征的视网膜变性疾病，引起失明的患者高达200万，不仅严重影响患者生存质量，而且增加社会负担，开展视网膜变性致盲性眼病研究是我国经济和社会的重大需求。目前，视网膜疾病的基础与临床研究是国际科技前沿的热点和难点。视网膜组织含有复杂的十类细胞类型，各类细胞之间相互连接，相互依存，组织结构精细；尤其是视网膜感光细胞发育、成熟过程漫长，需要经历视网膜干细胞增殖、视网膜感光祖细胞谱系发育、视网膜感光细胞亚型形成、突触连接和感光细胞外节生长等一系列阶段。目前已发现七种转录调控因子在哺乳动物视网膜感光细胞的发育过程中发挥重要的调控作用，这些因子包括OTX2、CRX、NRL、NR2E3、PIAS3、RORβ和TRβ2。视网膜感光祖细胞向视锥或视杆细胞分化的命运，取决于在特定时期这些转录因子的活跃或者沉默。这些转录因子网络的协同及精准控制，在视网膜感光祖细胞向视网膜感光细胞亚型视锥和视杆细胞分化中发挥重要作用。但是目前对于上述这些因子动态变化的调控机制尚未阐明。常规的基于群体的转录组分析方法无法揭示单个细胞之间基因表达的异质性，也难以对极少量稀有细胞进行分析，单细胞转录组分析技术为此供了有效的研究工具。单细胞转录组测序是作为推动干细胞生物学研究强大技术手段之一，它能呈现单个细胞转录组图谱，对测序获得的高通量数据进行系统的生物信息学分析和挖掘，从而揭示发育过程中不同细胞群体的转录因子变化规律，尤其适合揭示细胞命运转变过程中各类细胞转录组的变化规律。制备视网膜组织单细胞悬液，并使其符合细胞建库标准，对于阐述视网膜发育和视网膜疾病的发生发展至关重要。目前，国内外视觉科学研究领域中，体外获得视网膜的常用方法是用酶消化和显微解剖分离方法。然而，现有的这两种方法均耗时较长，一般需要15-25分钟。而实践证明，当视网膜离开活体15-25分钟后，视网膜神经细胞的死亡率可达40-60%；这显然对后续进行的视网膜基础与临床研究能否成功将产生较大影响，极有可能因为视网膜离体时间过长，造成研究结果失真的严重后果。因此，急需改进现有的视网膜取出技术，以便能快速、高效地取出视网膜，提高视网膜各类细胞的存活率，以便获得真实的研究结果，为防盲致盲的基础与临床研究提供技术支撑。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种视网膜组织/类器官-视网膜制备单细胞悬液的方法，以期能够解决现有技术耗时长、视网膜神经细胞的死亡率高的问题。本专利技术采用如下技术方案：设计一种基于视网膜组织制备单细胞悬液的方法，包括如下步骤：（1）充分冲洗眼球：首先用预冷的1×磷酸盐缓冲液（pH7.4）充分冲洗离体眼球，再用每毫升含有20IU庆大霉素的预冷生理盐水充分冲洗眼球1～3次，然后将眼球放在已预冷的眼球固定器上，剪除眼球表面的附属组织，保留四条直肌，然后将四条直肌固定在预冷的眼球固定器上；（2）获取视网膜神经层和后段眼球壁：在解剖显微镜下，用视网膜取出器一端的尖刀片，沿眼球赤道部切开全周眼球壁，去除眼前段，先用视网膜取出勺把晶状体和玻璃体取出，再用视网膜取出勺沿视网膜下腔取出完整的视网膜神经层，将视网膜神经层放入在冰上预冷的10毫升的离心管里，已取出视网膜神经层的半圆形后段眼球壁，继续放置在预冷的眼球固定架上；（3）消化视网膜组织：在装有视网膜神经层的离心管里，加入组织消化酶papain（使用浓度5mg/ml）和Collagenase（使用浓度5mg/ml）各1.5ml；在眼球固定器上的半圆形眼球壁内，按照1:1的比例加满上述两种组织消化酶，把这两部分组织放置在37℃保温箱内消化10-12分钟，每隔3min用塑料吸管轻柔吹打1次，直至显微镜下观察到单个圆形细胞一旦形成，马上将半圆形眼球内的细胞消化悬液吸出移到装有视网膜神经层组织的离心管里，根据离心管内两部分细胞消化悬液合并的体积，按1:1的比例加入含10%胎牛血清培养基终止消化；细胞悬液离心后去上清；（4）制备单细胞悬液：在含有细胞沉淀物的离心管内加入预冷的1X磷酸盐缓冲液（pH7.4）10ml,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的视网膜单细胞悬液离心后，去上清，加10%胎牛血清培养基3ml，混匀后即获得视网膜的单细胞悬浮液。另一种基于类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法，包括如下步骤：（1）收集类器官-视网膜组织：轻轻悬浮每个培养孔内类器官-视网膜的培养液，三个培养孔的类器官-视网膜悬液合并一起，移至预冷的10ml离心管，离心后去除上清液，用预冷的1X磷酸盐缓冲液(pH7.4)充分悬浮后，离心沉淀2次。（2）消化类器官-视网膜组织：在装有类器官-视网膜的离心管里，加入组织消化酶papain（使用浓度2.5mg/ml）和Collagenase（使用浓度2.5mg/ml）各1.5ml；放置在37°C保温箱内消化6-8分钟（消化时间可根据眼球的发育时间和视网膜消化为圆形单个细胞而定），每隔2分钟用软塑料吸管轻柔吹打1次（注意切勿不能用暴力吹打，以免细胞破碎），显微镜下观察类器官-视网膜组织被消化的情况，直至镜下观察到单个圆形单细胞形成，立即加入含10%胎牛血清培养基3ml终止消化；300g(1200rpm)，离心5分钟，去上清；（3）制备单细胞悬液：在含有细胞沉淀物的离心管内加入预冷的1X磷酸盐缓冲液（pH7.4）10ml,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的视网膜单细胞悬液离心后，去上清，加10%胎牛血清培养基3ml，混匀后即获得视网膜的单细胞悬浮液。所述视网膜取出器包括手柄，该手柄一端连接具有活动性视网膜取出勺，另一端连接具有活动性刀片夹，所述视网膜取出勺所在平面与手柄所在轴线呈一定倾角，所述刀片夹的前端装有一次性刀尖片。所述离心条件为：300g、1200rpm、离心5分钟。可按如下步骤检测所述单细胞悬液质量：取1微升细胞悬液加到CountatarRRigelS2型智能一体化荧光分析仪的进样孔内进行检测，每1微升细胞悬液内含有细胞存活率、总细胞浓度、细胞结团率、活细胞个数和死细胞个数等，细胞存活率大于90%以上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于视网膜组织制备单细胞悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）冲洗眼球/n首先用预冷的1X磷酸盐缓冲液冲洗离体眼球，再以含庆大霉素20IU/ml的预冷生理盐水充分冲洗眼球1～3次，然后将眼球放在已预冷的眼球固定器上，剪除其表面除四条直肌外的附属组织，最后将四条直肌固定在眼球固定器上；/n（2）获取视网膜神经层和后段眼球壁/n在解剖显微镜下，用视网膜取出器一端的尖刀片沿眼球赤道部切开全周眼球壁，去除眼前段，先用视网膜取出勺把晶状体和玻璃体取出，再用视网膜取出勺沿视网膜下腔取出完整的视网膜神经层，将视网膜神经层放入已预冷的离心管里，剩余的半圆形后段眼球壁则继续放置在预冷的眼球固定器上；/n（3）消化视网膜组织/n在装有视网膜神经层的离心管里，加入浓度均为5mg/ml组织消化酶papain和Collagenase各1.5ml；再向眼球固定器上的半圆形眼球壁内等比例加满上述两种组织消化酶，再将两部分组织均放在37℃保温箱内消化10-12分钟，每隔3min用软管吹打1次，直至显微镜下观察到单个圆形单细胞形成后立即将半圆形眼球壁内的细胞消化悬液转移至装有视网膜神经层组织的离心管里，再根据离心管内两部分视网膜细胞消化悬液合并后的体积，等体积加入含10%FBS细胞培养基，以终止消化；离心后去上清；/n（4）制备视网膜单细胞悬液/n在含有视网膜细胞沉淀物的离心管内加入预冷1X磷酸盐缓冲液10ml，并悬浮细胞,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的单细胞悬液离心后，去上清，加含有10%胎牛血清的培养基3ml，混匀后即得视网膜单细胞悬液。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于视网膜组织制备单细胞悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）冲洗眼球
首先用预冷的1X磷酸盐缓冲液冲洗离体眼球，再以含庆大霉素20IU/ml的预冷生理盐水充分冲洗眼球1～3次，然后将眼球放在已预冷的眼球固定器上，剪除其表面除四条直肌外的附属组织，最后将四条直肌固定在眼球固定器上；
（2）获取视网膜神经层和后段眼球壁
在解剖显微镜下，用视网膜取出器一端的尖刀片沿眼球赤道部切开全周眼球壁，去除眼前段，先用视网膜取出勺把晶状体和玻璃体取出，再用视网膜取出勺沿视网膜下腔取出完整的视网膜神经层，将视网膜神经层放入已预冷的离心管里，剩余的半圆形后段眼球壁则继续放置在预冷的眼球固定器上；
（3）消化视网膜组织
在装有视网膜神经层的离心管里，加入浓度均为5mg/ml组织消化酶papain和Collagenase各1.5ml；再向眼球固定器上的半圆形眼球壁内等比例加满上述两种组织消化酶，再将两部分组织均放在37℃保温箱内消化10-12分钟，每隔3min用软管吹打1次，直至显微镜下观察到单个圆形单细胞形成后立即将半圆形眼球壁内的细胞消化悬液转移至装有视网膜神经层组织的离心管里，再根据离心管内两部分视网膜细胞消化悬液合并后的体积，等体积加入含10%FBS细胞培养基，以终止消化；离心后去上清；
（4）制备视网膜单细胞悬液
在含有视网膜细胞沉淀物的离心管内加入预冷1X磷酸盐缓冲液10ml，并悬浮细胞,通过40微米滤网过滤视网膜单细胞悬液，将获得的单细胞悬液离心后，去上清，加含有10%胎牛血清的培养基3ml，混匀后即得视网膜单细胞悬液。


2.一种基于类器官-视网膜组织制备单细胞悬液的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）收集类...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭广华，王少军，
申请(专利权)人：郑州大学，
类型：发明
国别省市：河南;41