一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法技术

本发明专利技术公开了一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法。属于生物工程技术领域。包括将病毒接种于鸡胚尿囊腔，经病毒增殖、冷胚、澄清和灭活得病毒尿囊收获液；对流感病毒尿囊收获液进行浓缩和超滤膜透析处理，得病毒浓缩液；将病毒浓缩液凝胶层析收集洗脱液，得洗脱病毒液；在洗脱病毒液中加入裂解剂，震荡后，得裂解病毒液；超速离心处理裂解病毒液，收集蔗糖质量分数为3~15%之间的蛋白溶液；对蛋白溶液超滤膜透析和浓缩处理，收集得到脱糖蛋白溶液经滤膜过滤，即得流感病毒亚单位疫苗原液。本发明专利技术能降低流感病毒亚单位疫苗中的卵清蛋白、裂解剂和甲醛等杂质的含量，减少不良反应的发生，增加抗原收率及纯度，提高疫苗的安全性、有效性。

【技术实现步骤摘要】
一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法
本专利技术涉及生物工程
，更具体的说是涉及一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法。
技术介绍
流行性感冒（简称流感）是一种具有严重危害的病毒性急性呼吸道传染病，该病主要通过带有流感病毒的空气飞沫在人群中传播。在流感大流行期间，流感的发病率可达5%～30%，严重的病例可引起病毒性肺炎和继发细菌性感染，患慢性呼吸道疾病的老人，其死亡率可达1/1500。流感疫苗是预防流感爆发和流行的最有效措施。目前国际上已经上市的流感疫苗有流感灭活疫苗、流感减毒活疫苗和重组疫苗.流感灭活疫苗有全病毒疫苗、裂解病毒疫苗和亚单位疫苗三种。20世纪末，在流感病毒裂解疫苗的基础上，通过选择合适的裂解剂和裂解条件，将流感病毒膜蛋白HA和NA裂解下来，再用适当的方法得到纯化的HA和NA蛋白制备成亚单位疫苗该疫苗比以上两种疫苗具有更好的安全性和良好的抗原性。目前流感病毒亚单位疫苗生产，纯化工艺一般采用三步纯化：流感病毒洗滤纯化、裂解前纯化、流感病毒裂解后纯化，或者是，流感病毒洗滤纯化、流感病毒裂解时纯化、裂解后纯化。裂解前纯化或裂解时纯化普遍采用区带离心法去除卵白及杂蛋白，区带离心法对设备要求较高，操作时间长，样品处理量小，收率也偏低；主要抗原组分的存在以及纯度对保证疫苗的免疫原性至关重要。因此，如何提供一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法，降低流感病毒亚单位疫苗中的卵清蛋白、裂解剂和甲醛等杂质的含量，减少不良反应的发生，增加抗原收率及纯度，提高疫苗的安全性、有效性是本领域技术人员亟需解决的问题。r>
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法。采用凝胶层析法进行裂解前纯化、流感病毒裂解后进行蔗糖等密度梯度区带离心收集抗原的工艺制备原液。凝胶过滤层析法操作简单，样品收率较高，适于大规模生产。裂解后采用区带离心能够再次有效去除杂蛋白和充分回收HA抗原。制备的原液能够大大降低流感病毒亚单位疫苗中的卵清蛋白、裂解剂和甲醛等杂质的含量，减少不良反应的发生，提高疫苗的安全性和有效性。本方法为生产制造企业提供了一条简便高效可行、提高产品质量的解决方案。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法，包括以下步骤：（1）将病毒接种于鸡胚尿囊腔，经病毒增殖、冷胚、澄清和灭活得病毒尿囊收获液；（2）超滤浓缩I：对流感病毒尿囊收获液超滤浓缩处理，得病毒浓缩液，再经透析处理；（3）纯化病毒：将透析后的病毒浓缩液凝胶层析收集洗脱液，得洗脱病毒液；（4）裂解病毒：在洗脱病毒液中加入裂解剂，震荡后，得裂解病毒液；（5）纯化抗原：超速离心处理裂解病毒液，收集蔗糖质量分数为3~15%之间的蛋白溶液；（6）超滤浓缩II：对步骤（5）得到的蛋白溶液超滤浓缩处理，得浓缩蛋白溶液，再经透析处理，得脱糖蛋白溶液；（7）将脱糖蛋白溶液经滤膜过滤，即得流感病毒亚单位疫苗原液；步骤（2）超滤和透析的膜规格为相对分子量300kD；浓缩的程度至流感病毒尿囊收获液与病毒浓缩液的体积比为（30~70）：1；透析的透析液与病毒浓缩液的体积比为（5~10）：1；步骤（6）超滤和透析的膜规格为相对分子质量100kD，浓缩的程度至蛋白溶液与浓缩蛋白溶液的体积比为（10~30）：1；透析的透析液和浓缩蛋白溶液体积比（5~10）：1。有益效果在于：采用上述方法可以用较少的透析液达到脱糖目的，减少透析过程中抗原损失，提高收率；采用上述透析与浓缩方法可以提高病毒回收率。优选的：步骤（1）病毒接种：将流感病毒接种于9~11日龄健康鸡胚尿囊腔中；病毒增殖：将接种后的鸡胚置于33~35℃孵箱培养36~72小时，增殖流感病毒；冷胚：筛选病毒增殖后的活鸡胚置于2~8℃，时间12~24小时，收获尿囊液；澄清：用离心法或者过滤法澄清，除去不溶性杂质，得单价病毒合并液；灭活：将单价病毒合并液加入终浓度不高于200μg/ml的甲醛灭活96~168小时，得流感病毒尿囊收获液。进一步的，离心转速不低于10000rpm；过滤法澄清使用孔径0.65μm滤芯。进一步的：步骤（3）凝胶层析为琼脂糖凝胶层析，使用K50/100的Sepharose4FF凝胶层析柱，平衡缓冲液和洗脱液为0.01mol/LPBS，pH7.2；流速15ml/min。步骤（4）裂解剂为trionN101，终浓度0.5%，震荡温度为室温，震荡时间3h。优选的：步骤（5）具体为：1）分别配制质量分数为5~15%，20~30%和40~50%的蔗糖溶液；启动超速离心机，在3000rpm，18~26℃条件下抽真空，加入PBS或生理盐水排转子中气泡，依次加入质量分数为5~15%，20~30%的蔗糖溶液制作梯度层；2）设定25000~30000rpm，温度18~25℃，将裂解病毒液为样品加入离心机，控制流速为15~30ml/min，上样量不大于8L/台次；样品加完后，加入PBS、控制流速10ml/min持续运行0.5~4h，然后离心机转速降到3000rpm，由离心机边孔进质量分数为40~50%的蔗糖溶液，收集蔗糖质量分数为3~15%之间的蛋白溶液。有益效果在于：采用上述方法，可以提高蛋白溶液的纯度。优选的：步骤（7）滤膜规格为0.22μm。本专利技术还提供了一种上述制备方法或制备得到的原液在制备流感病毒亚单位疫苗中的应用。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法，取得的技术效果为本专利技术能降低流感病毒亚单位疫苗中的卵清蛋白、裂解剂和甲醛等杂质的含量，减少不良反应的发生，增加抗原收率及纯度，提高疫苗的安全性、有效性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为常规工艺流程示意图。图2附图为本专利技术提供的制备方法示意图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术实施例公开了一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法。实施例1病毒接种、培养、收获和灭活从工作种子库中H3N2型取毒种1支，稀释到终浓度为3.0LgEID50，以0.2ml/胚的剂量接种于（9~11日龄健康）鸡胚尿囊腔，置33~35℃温室培养36~72小时（本次实验为34℃，培养50小时）。培养结束后筛选活鸡胚，置2~8℃冷胚12~本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：/n（1）将病毒接种于鸡胚尿囊腔，经病毒增殖、冷胚、澄清和灭活得病毒尿囊收获液；/n（2）超滤浓缩I：对流感病毒尿囊收获液超滤浓缩处理，得病毒浓缩液，再经透析处理；/n（3）纯化病毒：将透析后的病毒浓缩液凝胶层析收集洗脱液，得洗脱病毒液；/n（4）裂解病毒：在洗脱病毒液中加入裂解剂，震荡后，得裂解病毒液；/n（5）纯化抗原：超速离心处理裂解病毒液，收集蔗糖质量分数为3~15%之间的蛋白溶液；/n（6）超滤浓缩II：对步骤（5）得到的蛋白溶液超滤浓缩处理，得浓缩蛋白溶液，再经透析处理，得脱糖蛋白溶液；/n（7）将脱糖蛋白溶液经滤膜过滤，即得流感病毒亚单位疫苗原液；/n步骤（2）所述超滤和所述透析的膜规格为相对分子量300 kD；所述浓缩的程度至流感病毒尿囊收获液与病毒浓缩液的体积比为（30~70）：1；所述透析的透析液与所述病毒浓缩液的体积比为（5~10）：1；/n步骤（6）所述超滤和所述透析的膜规格为相对分子质量100 kD，所述浓缩的程度至蛋白溶液与浓缩蛋白溶液的体积比为（10~30）：1；所述透析的透析液和所述浓缩蛋白溶液体积比（5~10）：1。/n...

【技术特征摘要】
1.一种流感病毒亚单位疫苗原液制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将病毒接种于鸡胚尿囊腔，经病毒增殖、冷胚、澄清和灭活得病毒尿囊收获液；
（2）超滤浓缩I：对流感病毒尿囊收获液超滤浓缩处理，得病毒浓缩液，再经透析处理；
（3）纯化病毒：将透析后的病毒浓缩液凝胶层析收集洗脱液，得洗脱病毒液；
（4）裂解病毒：在洗脱病毒液中加入裂解剂，震荡后，得裂解病毒液；
（5）纯化抗原：超速离心处理裂解病毒液，收集蔗糖质量分数为3~15%之间的蛋白溶液；
（6）超滤浓缩II：对步骤（5）得到的蛋白溶液超滤浓缩处理，得浓缩蛋白溶液，再经透析处理，得脱糖蛋白溶液；
（7）将脱糖蛋白溶液经滤膜过滤，即得流感病毒亚单位疫苗原液；
步骤（2）所述超滤和所述透析的膜规格为相对分子量300kD；所述浓缩的程度至流感病毒尿囊收获液与病毒浓缩液的体积比为（30~70）：1；所述透析的透析液与所述病毒浓缩液的体积比为（5~10）：1；
步骤（6）所述超滤和所述透析的膜规格为相对分子质量100kD，所述浓缩的程度至蛋白溶液与浓缩蛋白溶液的体积比为（10~30）：1；所述透析的透析液和所述浓缩蛋白溶液体积比（5~10）：1。


2.根据权利要求1所述的流感病毒亚单位疫苗原液制备方法，其特征在于：步骤（1）所述病毒接种：将流感病毒接种于9~11日龄健康鸡胚尿囊腔中；
所述病毒增殖：将接种后的鸡胚置...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵斌，高辉，胡文浩，李小美，王丽，李响响，
申请(专利权)人：天津中逸安健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12