【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗制造，更具体的说是涉及一种狂犬病疫苗保护剂及含有其疫苗的制备方法。
技术介绍
1、狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus)感染引起的一种人畜共患的动物源性传染病。狂犬病病毒主要通过破损的皮肤或粘膜侵入人体，临床特征为脑脊髓炎，大多表现为特异性恐风、恐水、咽肌痉挛、进行性瘫痪等。一旦出现临床症状，几乎100％死亡。在暴露前暴露后或为人类接种疫苗是一种有效的预防干预措施。狂犬病疫苗非常有效、安全且耐受性良好。
2、无血清人用狂犬病疫苗，由于培养过程不添加任何动物血清，纯化过程也不添加任何蛋白，纯化后的病毒液总蛋白浓度远低于用牛血清培养系统生产的疫苗，因此，无血清人用狂犬病疫苗需要保护效果更好的保护剂，研究保护剂的配方和工艺制备就显得非常重要。
3、对于含血清生产的人用疫苗，人血白蛋白、明胶和右旋糖苷是冻干常用保护剂，这三种成分也常常被用作无血清人用狂犬病疫苗的保护剂，但接种者不良反应率显著提高。
4、人血白蛋白来源于人血浆，是一种经典、优良的稳定剂，尤其是在冻干制品中，能够对蛋白质的活性起到很好的保护作用。但由于人血白蛋白在疾病治疗中需求量大，价格高，同时存在潜在的血源性疾病传播风险，对其使用提出更多的研究支持。
5、明胶曾广泛用于病毒性疫苗的稳定剂，由动物胶原水解得到，来源于牛、猪等动物。过去各种病毒性疫苗中均使用牛源明胶，但是日本在1993年开始陆续出现全身性荨麻疹、血管性水肿、喉头水肿、喘鸣等各种过敏反应报告。并且来源于牛或猪的明胶具有携
6、从2000年开始，国内外开始将右旋糖苷引入疫苗保护剂，用以替代明胶，但近年来发现，右旋糖苷偶有过敏反应如荨麻疹、皮肤瘙痒、发热、恶心、呕吐、喘息、关节痛、出血等，极个别的有血压下降、呼吸困难和胸闷，严重的会出现过敏性休克。
7、因此，迫切需要开发出一种新型的无血清人用狂犬病疫苗保护剂，并且连同无血清培养技术工艺一起开发，有利于产业化发展。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种适用于狂犬病疫苗、安全、稳定的保护剂及含有其疫苗的制备方法，以解决现有技术中的不足。
2、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、一种狂犬病疫苗保护剂，包括以下质量百分比的原料：海藻糖0.5％-2％、蔗糖或麦芽糖3％-7％、山梨醇或甘露醇0.45％-0.75％、尿素0.42％-1.2％、谷氨酸钠0.05％-0.2％和精氨酸或精氨酸盐0.03％-0.06％，余量为缓冲液。
4、优选为：海藻糖0.5％-2％、麦芽糖3％-7％、甘露醇0.45％-0.75％、尿素0.42％-1.2％、谷氨酸钠0.05％-0.2％和精氨酸盐0.03％-0.06％，余量为缓冲液。
5、进一步，上述海藻糖与蔗糖或麦芽糖的质量比例≥1:6；海藻糖与山梨醇或甘露醇的质量比≥1:1。
6、进一步，上述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、tris缓冲液或m199培养基。更进一步，上述缓冲液的ph为6.8-8.0；磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液的摩尔浓度为0.2mol/l；tris缓冲液的摩尔浓度为5-30mmol/l。
7、一种含有上述狂犬病疫苗保护剂的狂犬病疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
8、(1)复苏vero细胞并进行连续传代培养，将细胞扩增至细胞培养载体上，在生物反应器中进行培养，然后接种狂犬病毒疫苗株，收获培养上清液，得到收获液a；
9、(2)将收获液a进行澄清过滤，得到收获液b；
10、(3)采用离子交换层析的方法对收获液b中的病毒进行纯化，上柱后狂犬病毒被吸附在层析柱的离子介质中，再用缓冲液洗脱出狂犬病病毒，得到收获液c；
11、(4)采用琼脂糖凝胶对收获液c进行脱盐层析，得到收获液d；
12、(5)采用dna核酸酶降解收获液d中的宿主残余dna，得到收获液e；
13、(6)将β-丙内酯加入收获液e中，先第一次放置使狂犬病毒灭活，然后第二次放置使β-丙内酯水解，得到收获液f；
14、(7)采用超滤膜对收获液f进行超滤透析，收集浓缩的灭活狂犬病毒，得到收获液g；
15、(8)将上述狂犬病疫苗保护剂加入收获液g中，即得狂犬病疫苗。
16、进一步，上述步骤(1)中，连续传代培养过程中的细胞生长液使用无血清培养基；连续传代培养的代次不超过160代；细胞培养载体为片状载体或球状微载体，表面积为400m2；培养采用连续灌流方式，溶氧为60％，搅拌速度为40rpm，温度为37℃；狂犬病毒疫苗株为pm株或ctn株。
17、进一步，上述步骤(2)中，澄清过滤的方法为使用过滤器和/或连续流离心。
18、进一步，上述步骤(3)中，缓冲液为中性的0.8mol/lnacl的tris缓冲液；洗脱过程中上样和洗脱的流速为260cm/hr，柱耐压上限为0.3mpa，平衡液为10mmol/lnacl的tris-hcl缓冲液。
19、进一步，上述步骤(5)中，dna核酸酶的纯度为99.9％，活性单位浓度为10-150u/ml；降解的温度为37℃，时间为2h。
20、进一步，上述步骤(6)中，β-丙内酯和收获液e的质量比为1:(2000-4000)；第一次放置的温度为2-8℃，时间为40h；第二次放置的温度为36-38℃，时间为2h，每隔0.5h振摇一次。
21、进一步，上述步骤(7)中，超滤膜的截留分子量为100-300kd，面积为0.1-0.5m2。
22、进一步，上述步骤(8)中，还包括冷冻干燥，冷冻干燥的程序为：隔板预冷至4℃，放入西林瓶，预冻：-50℃，一次干燥温度：-50至-15℃，二次干燥温度：-15℃至25℃；或，隔板预冷至4℃，放入西林瓶，将隔板预冻至-40℃以下，开始第一次干燥，第一次升华在-25℃以内完成，第二次干燥在40℃以内完成。
23、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：
24、1.本专利技术狂犬病毒采用无血清培养基生产，生产全过程不含小牛血清或胎牛血清，组成不含有明胶或水解明胶和右旋糖苷，以及任何动物来源的外源物质，在保证疫苗稳定性的同时，降低疫苗过敏反应风险，并能够降低生产成本，提高疫苗质量。
25、2.本专利技术无血清人用狂犬病疫苗保护剂能使纯化和灭活的狂犬病毒保持稳定(尤其在较高温度下)，对液体剂型、冻干剂型均可起到抗原和效力的保护作用，尤其保持了狂犬病疫苗的热稳定性。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，包括以下质量百分比的原料：海藻糖0.5％-2％、蔗糖或麦芽糖3％-7％、山梨醇或甘露醇0.45％-0.75％、尿素0.42％-1.2％、谷氨酸钠0.05％-0.2％和精氨酸或精氨酸盐0.03％-0.06％，余量为缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，包括以下质量百分比的原料：海藻糖0.5％-2％、麦芽糖3％-7％、甘露醇0.45％-0.75％、尿素0.42％-1.2％、谷氨酸钠0.05％-0.2％和精氨酸盐0.03％-0.06％，余量为缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，所述海藻糖与蔗糖或麦芽糖的质量比例≥1:6；所述海藻糖与山梨醇或甘露醇的质量比≥1:1。
4.根据权利要求1或2所述的一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、Tris缓冲液或M199培养基。
5.根据权利要求4所述的一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，所述缓冲液的pH为6.8-8.0；所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液的摩尔浓度为0
6.一种含有如权利要求1所述狂犬病疫苗保护剂的狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的一种狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述连续传代培养过程中的细胞生长液使用无血清培养基；所述连续传代培养的代次不超过160代；所述细胞培养载体为片状载体或球状微载体，表面积为400m2；所述培养采用连续灌流方式，溶氧为60％，搅拌速度为40rpm，温度为37℃；所述狂犬病毒疫苗株为PM株或CTN株；
8.根据权利要求6所述的一种狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述缓冲液为中性的0.8mol/LNaCl的Tris缓冲液；所述洗脱过程中上样和洗脱的流速为260cm/hr，柱耐压上限为0.3MPa，平衡液为10mmol/LNaCl的Tris-HCl缓冲液。
9.根据权利要求6所述的一种狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(5)中，所述DNA核酸酶的纯度为99.9％，活性单位浓度为10-150U/mL；所述降解的温度为37℃，时间为2h；
10.根据权利要求6所述的一种狂犬病疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(7)中，所述超滤膜的截留分子量为100-300KD，面积为0.1-0.5m2；
...【技术特征摘要】
1.一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，包括以下质量百分比的原料：海藻糖0.5％-2％、蔗糖或麦芽糖3％-7％、山梨醇或甘露醇0.45％-0.75％、尿素0.42％-1.2％、谷氨酸钠0.05％-0.2％和精氨酸或精氨酸盐0.03％-0.06％，余量为缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，包括以下质量百分比的原料：海藻糖0.5％-2％、麦芽糖3％-7％、甘露醇0.45％-0.75％、尿素0.42％-1.2％、谷氨酸钠0.05％-0.2％和精氨酸盐0.03％-0.06％，余量为缓冲液。
3.根据权利要求1或2所述的一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，所述海藻糖与蔗糖或麦芽糖的质量比例≥1:6；所述海藻糖与山梨醇或甘露醇的质量比≥1:1。
4.根据权利要求1或2所述的一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，所述缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、tris缓冲液或m199培养基。
5.根据权利要求4所述的一种狂犬病疫苗保护剂，其特征在于，所述缓冲液的ph为6.8-8.0；所述磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液的摩尔浓度为0.2mol/l；所述tris缓冲液的摩尔浓度为5-30mmol/l。
6.一种含...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘泽，
申请(专利权)人：天津中逸安健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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