【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，更具体的说是涉及一种重组流感亚单位疫苗肠溶性软胶囊及其制备方法。
技术介绍
1、流行性感冒病毒（简称流感），是一种全球性传染病，人群普遍易感，传播力强。目前，接种流感疫苗仍然是保护机体免受侵害、预防流感以及降低流感并发症的有效的防御机制。目前，国内外流感疫苗生产方式主要源于鸡胚基质，但由于其生产条件的局限性，如缺乏灵活性、依赖鸡胚供应、存在污染风险及鸡胚适应性病毒突变等，越来越多的药企开始着手研究新的流感疫苗的生产方式或表达系统，如基于昆虫细胞杆状病毒系统生产重组流感亚单位疫苗、mrna流感疫苗和基于细胞基质（mdck、vero）生产流感疫苗等等。任何药物成分的生产系统，尤其是疫苗，都必须对需求的突然增加做出快速的反应。微藻目前被认为是最具潜力、最能实现可持续供给的生物质资源之一。微藻的表达具有较低的制造成本，可以快速调整，同时企业不需要昂贵的发酵设备来生产，也不需要建造扩大生产的重复设施。相对于以上几种表达系统或生产方式而言，微藻生产平台越来越受欢迎，这是因为微藻表达系统生产成本较低，易繁殖培养，适宜规模化培养，可扩展性好，同时保持比细胞培养更低的生产成本，避免可能的哺乳动物病原体污染问题，表达的重组蛋白活性高，具有真核系统转录后加工以及翻译后加工的功能，能够表达高活性的功能蛋白。
2、血凝素ha是流感病毒表面的一种糖蛋白，更是流感病毒的关键免疫原，具有凝集红细胞的能力。流感病毒的ha蛋白能够诱导机体产生中和抗体，是疫苗研发的首选靶向蛋白，ha基因由重链ha1和轻链ha2两部分组成，其中ha1有
3、传统接种流感疫苗多采用注射的方式，但存在生产成本费用高、患者不易接受、需专业医护人员接种等问题。从依从性和市场份额来看，口服途径是一种重要的疫苗接种方式，且倍受青睐，更是给药系统研究的热点。但由于受胃肠道因素的影响多数蛋白类药物易失活且吸收差，致使生物利用度低，其口服疫苗给药系统研究仍面临诸多挑战，尽管口服接种与胃肠外注射相比有许多优点，但肠道内疫苗的降解及吸收限制仍然增加了口服疫苗开发的难度。与其他剂型相比，肠溶性软胶囊具有掩盖药物不良气味、体内生物利用度高、隔绝空气进而使药物的稳定性提高等优点。肠溶性软胶囊是将药物与适量辅料混合制备成溶液、乳状液、混悬液或者半固体制剂，再通过滴制法或压制法将其包封于类球形、椭圆形或异型的软胶囊囊壳中形成的制剂。肠溶性软胶囊制剂指通过在囊壳内添加特殊的药用高分子材料或经特殊处理后，在胃内不溶解，到达肠道部位才开始崩解、释放药物活性成分而发挥局部或全身治疗作用的胶囊剂。肠溶性软胶囊除了具有普通软胶囊的优点之外，还具有独特的优势：避免药物受胃内ph及酶类的影响，提高药物稳定性；将药物定向输送至肠道，在肠道形成均匀的高分散体系，发挥局部或全身治疗作用，同时可减少药物对胃黏膜的刺激而产生的恶心、呕吐等副作用，从而减少患者的不适，且提高药物的生物利用度等。当前，将流感疫苗开发成肠溶性软胶囊的研究仍未见报道。但重组流感亚单位疫苗肠溶性软胶囊同样也存在一些亟待考虑的问题，如何保证抗原蛋白的含量、延长药物在肠道靶点作用时间、如何增强免疫原性、保证抗原蛋白不易降解以及提高产品的安全性（如：生殖毒性和致精子畸形作用）等。
4、鉴于此，开发一种基于微藻表达系统的易于放大生产、成本低的重组流感亚单位疫苗肠溶性软胶囊是本领域技术人员亟需解决的技术问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提供了一种重组流感亚单位疫苗肠溶性软胶囊及其制备方法。
2、本专利技术克服了现有技术中流感亚单位疫苗抗原蛋白含量低、接种途径单一、免疫原性弱、抗原蛋白易降解、抗原蛋白免疫时间短等缺陷。
3、本专利技术进行了如下工作：其一、敲除小球藻基因组fad3基因，通过多基因串联的方式将四种流感病毒（h1n1、h3n2、b victoria lineage和b yamagata lineage）的血凝素ha1基因和人源igg1-fc基因构成融合基因，将融合基因整合到小球藻基因组敲除位点，改变小球藻藻细胞的代谢途径，并通过高密度发酵达到高效制备融合蛋白的目的；其二、制备口服剂型的重组流感亚单位疫苗肠溶性软胶囊，其内容物中同时含有四种流感毒株（h1n1、h3n2、b victoria lineage和b yamagata lineage）的ha1基因，并与人源igg1-fc基因进行串联组合，将口服的重组流感亚单位疫苗制备成肠溶性软胶囊，该方法增强了重组流感疫苗的免疫原性，增加了产品的稳定性，具有较大的市场推广价值和应用前景；其三、将软胶囊内容物制备成原位温敏凝胶状态，在给药部位凝胶化以实现定位黏附给药，延长了药物在黏膜组织上的停留时间，实现了药物的持续渗透，从而增加了抗原蛋白的累积渗透效果。
4、为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
5、一种重组流感亚单位疫苗肠溶性软胶囊，包括软胶囊内容物、软胶囊壳和肠溶包衣；
6、所述软胶囊内容物包括融合蛋白、保护剂、乳化剂a和乳化剂b；
7、所述融合蛋白为含有流感毒株h1n1、h3n2、b victoria lineage和b yamagatalineage毒株的血凝素ha1基因与人源igg1-fc基因的转基因小球藻生产的融合蛋白；
8、所述保护剂包括甘露聚糖、苏氨酸和碳酸氢钠；
9、所述乳化剂a为吐温-20或玉米纤维胶；
10、所述乳化剂b为泊洛沙姆407、泊洛沙姆188或壳聚糖中的一种或多种；
11、所述软胶囊壳包括菌菇抗氧化肽、魔芋胶、甘油、二氧化钛和聚乙二醇，其中，菌菇抗氧化肽、魔芋胶、甘油、二氧化钛的质量比为10~25:0.01~0.5:0.1~1:0.3~3；聚乙二醇的添加量为菌菇抗氧化肽、魔芋胶、甘油、二氧化钛四者之和的10~45%；
12、所述肠溶包衣包括羧甲基纤维素、维生素c、壳聚糖、碳酸氢钠、柠檬黄和无菌水。
13、进一步的，所述融合蛋白的制备方法如下：
14、（1）重组载体的构建
15、a1、融合基因表达盒的构建
16、流感毒株h1n1（简称h1）、h3n2（简称h3）、b victoria lineage（简称bv）和byamagata lineage（简称by）；分别将流感毒株h1、流感毒株h3、流感毒株bv和流感毒株by的血凝素ha1基因与人源igg1-fc基因（简称fc基因）进行组合，构建成融合基因，融合基因的上游添加5’端同源臂，融合基因的下游添加3’端同源臂，以串联的方式连接到pet-28a(+)载体上；
17、a2、sgrna的设计
18、选取小球藻基因组fad3基因（genbank:kx100035.1）进行基因敲除，在fad3基因上设计sgrna，sgrna基本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组流感亚单位疫苗肠溶性软胶囊，其特征在于，包括软胶囊内容物、软胶囊壳和肠溶包衣；
2.如权利要求1所述的肠溶性软胶囊，其特征在于，所述融合蛋白与保护剂的体积比为1~7:0.01~0.5；
3.如权利要求1所述的肠溶性软胶囊，其特征在于，所述菌菇抗氧化肽的制备方法如下：
4.如权利要求1所述的肠溶性软胶囊，其特征在于，所述肠溶包衣包括如下质量份数的组分：羧甲基纤维素0.1~0.8份、维生素C 0.04~0.5份、壳聚糖0.5~3份、碳酸氢钠0.01~0.05份、柠檬黄0.01~0.05份和无菌水5~15份。
5.如权利要求1所述的肠溶性软胶囊，其特征在于，所述肠溶性软胶囊的重量为0.05~0.1g/粒；
6.权利要求1~5任一所述的肠溶性软胶囊的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（11）中均质机参数为：500~10000r/min，4~20℃条件下，30~50MPa压力均质5~30min。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，
9.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）的具体操作为：将肠溶包衣原料置于搅拌桶中搅拌30~120min，调节pH值至7.0~7.2，过30~100目筛，之后将其用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，即为肠溶包衣液。
10.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（5）中包衣过程中的温度为4~20℃。
...【技术特征摘要】
1.一种重组流感亚单位疫苗肠溶性软胶囊，其特征在于，包括软胶囊内容物、软胶囊壳和肠溶包衣；
2.如权利要求1所述的肠溶性软胶囊，其特征在于，所述融合蛋白与保护剂的体积比为1~7:0.01~0.5；
3.如权利要求1所述的肠溶性软胶囊，其特征在于，所述菌菇抗氧化肽的制备方法如下：
4.如权利要求1所述的肠溶性软胶囊，其特征在于，所述肠溶包衣包括如下质量份数的组分：羧甲基纤维素0.1~0.8份、维生素c 0.04~0.5份、壳聚糖0.5~3份、碳酸氢钠0.01~0.05份、柠檬黄0.01~0.05份和无菌水5~15份。
5.如权利要求1所述的肠溶性软胶囊，其特征在于，所述肠溶性软胶囊的重量为0.05~0.1g/粒；
6.权利要求1~5任一所述的肠溶性软胶囊的制...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘金龙，邢黎军，张艳，高辉，
申请(专利权)人：天津中逸安健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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