一种重组流感亚单位疫苗的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种重组流感亚单位疫苗的制备方法。属于生物技术领域。本发明专利技术将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组的方式整合到杆状病毒基因组上，经过多级高密度发酵和纯化，对半成品进行初步筛选鉴定，将符合要求的半成品制备成鼻喷剂，对合格的产品灌装处理。本发明专利技术获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA抗原蛋白。与现有技术相比，本发明专利技术取得的有益效果为：缩短了重组流感亚单位疫苗的生产周期，提高了外源基因的表达量，且产品无弹状病毒和杆状病毒的污染。污染。污染。

【技术实现步骤摘要】
一种重组流感亚单位疫苗的制备方法


[0001]本专利技术涉及生物
，更具体的说是涉及一种重组流感亚单位疫苗的制备方法。

技术介绍

[0002]流感即流行性感冒，是由流感病毒引起的一种急性呼吸道疾病，流感给人类健康带来巨大危害和潜在威胁。接种疫苗是预防和控制流感病毒感染最有效方法之一。目前，市面上的四价流感亚单位疫苗和流感裂解疫苗等的主要抗原仍以血凝素(HA)蛋白研究为主，流感病毒的血凝素是引起宿主产生保护性抗体应答的主要抗原，且在与宿主细胞表面受体结合、膜融合、病毒颗粒包装结合和病毒粒子致病性等多方面发挥着重要作用，HA仍然是疫苗研制的重要靶抗原。
[0003]国内外流感疫苗大多是鸡胚疫苗，这种疫苗传统生产工艺固然成熟，但仍存在很多缺陷，如生产成本高、产量不稳定、劳动强度大，生产周期较长，病毒容易变异，易引起过敏反应，一旦发生流感大流行，难以在短时间内制备出足够数量的疫苗。
[0004]与鸡胚基质生产流感疫苗相比，细胞流感疫苗具有较多的优势，如生产周期短、工艺采用相对密闭的生物反应器系统，可有效降低微生物污染风险、疫苗不含卵清蛋白，可降低接种后过敏反应风险。细胞基质来源的流感疫苗虽然优势多于鸡胚法生产的流感疫苗，但也存在着一些问题，如细胞复苏的过程不能保证批次间稳定、传统的生物反应器对细胞的剪切力较大、需要去除生物制品中核酸残留和污染、如何保证产品中无弹状病毒和杆状病毒的污染。建立高效的流感疫苗扩增系统是细胞培养的流感疫苗生产的关键步骤。
[0005]综上，鉴于此，如何提供一种高效生产重组流感亚单位疫苗是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术提供了一种重组流感亚单位疫苗的制备方法。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]一种重组流感亚单位疫苗的制备方法，将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组的方式整合到杆状病毒基因组上，经过多级高密度发酵和纯化，获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA抗原蛋白；
[0009]甲型H1N1毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0010]ATGAAGGCCATCCTGGTTGTGATGCTGTACACATTCACAACTGCCAACGCTGACACCCTCTGCATCGGCTACCACGCTAACAACAGCACTGACACCGTCGACACAGTCCTGGAAAAGAACGTGACTGTGACCCACAGCGTGAACCTGCTGGAGGACAAGCACAACGGAAAGCTGTGTAAGCTGCGCGGCGTGGCTCCACTGCACCTCGGCAAGTGTAACATCGCTGGATGGATCTTGGGTAACCCAGAATGCGAATCCCTGAGCACAGCCCGCTCCTGGTCATACATCGTGGAGACCTCCAACAGCGACAACGGAACATGCTACCCAGGTGACTTCATCAACTACGAAGAACTCCGCGAGCAGCTCAGCTCC
GTGAGCAGCTTCGAGCGTTTCGAGATCTTCCCTAAGACTAGCAGCTGGCCAAACCACGACTCTGACAACGGAGTGACTGCTGCTTGCCCTCACGCCGGTGCTAAGTCCTTCTACAAGAATCTGATCTGGCTGGTGAAGAAGGGCAAGAGCTACCCCAAGATCAACCAAACATACATCAACGACAAGGGAAAGGAGGTTCTCGTGCTGTGGGGCATCCACCACCCTCCAACAATCGCCGACCAGCAGAGCCTCTACCAGAACGCTGATGCTTACGTTTTCGTGGGCACCTCTCGCTACAGCAAGAAGTTCAAGCCAGAAATCGCCACCAGGCCAAAGGTGCGTGACCAAGAAGGACGTATGAACTACTACTGGACCCTCGTTGAACCAGGAGACAAGATCACATTCGAAGCTACCGGCAACCTGGTGGCCCCTCGTTACGCCTTCACAATGGAACGTGATGCTGGTTCAGGTATCATCATCTCTGACACCCCTGTCCACGACTGCAACACAACTTGTCAAACTCCTGAGGGTGCTATCAACACCTCTCTGCCCTTCCAAAACGTCCACCCTATCACTATCGGCAAGTGTCCAAAGTACGTTAAGTCCACCAAGCTCAGGCTCGCTACTGGCCTCCGTAACGTGCCATCAATCCAAAGCCGTGGACTGTTCGGAGCCATCGCTGGTTTCATCGAAGGTGGATGGACCGGTATGGTGGATGGCTGGTACGGTTACCACCACCAAAACGAACAGGGCTCCGGATACGCCGCCGACCTGAAGAGCACACAGAACGCTATCGACAAGATCACCAACAAGGTGAACAGCGTGATCGAAAAGATGAACACCCAGTTCACCGCTGTGGGAAAGGAGTTCAACCACCTGGAGAAGCGCATCGAGAACCTGAACAAGAAGGTCGATGACGGCTTCCTGGACATCTGGACCTACAACGCCGAACTCCTGGTCCTGCTGGAGAACGAGCGTACCCTGGACTACCACGACTCCAACGTGAAGAACCTCTACGAGAAGGTGCGCAACCAACTGAAGAACAACGCCAAGGAGATCGGCAACGGCTGCTTCGAGTTCTACCATAAGTGTGACAACACCTGTATGGAGTCCGTGAAGAACGGAACTTACGACTACCCTAAGTACTCTGAAGAGGCTAAGCTGAACCGCGAAAAGATCGACGGAGTCAAGCTGGACTCCACTCGTATCTACCAGATCTTGGCCATCTACTCTACCGTGGCCAGCTCCCTCGTGCTGGTTGTCTCACTCGGCGCCATCAGCTTCTGGATGTGCTCTAACGGTTCACTGCAGTGTCGTATCTGCATCTAA；SEQ ID NO.1；
[0011]甲型H3N2毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0012]ATGAAAACAATCATCGCCCTGAGCAACATCCTGTGCCTGGTGTTCGCTCAGAAGATCCCAGGTAACGACAACTCCACCGCCACTCTGTGCCTGGGACACCACGCTGTGCCAAACGGCACTATCGTTAAGACAATCACCAACGACCGCATCGAAGTGACTAACGCTACTGAGCTCGTTCAAAACTCCTCAATCGGCGAGATCTGTGGTTCTCCACACCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组流感亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，将流感甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系4种毒株的HA基因通过同源重组的方式整合到杆状病毒基因组上，经过多级高密度发酵和纯化，获得甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata系和乙型Victoria系的HA抗原蛋白；甲型H1N1毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；甲型H3N2毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；乙型Yamagata系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；乙型Victoria系毒株的HA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的一种重组流感亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）构建重组质粒：（11）构建重组质粒：将甲型H1N1病毒和甲型H3N2病毒的HA基因分别添加至pOET5.1的载体的多克隆位点上，形成pOET5.1
‑
HA1
‑
HA2
‑
A；将乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒的HA基因分别添加至pOET5.1的载体的多克隆位点上，形成pOET5.1
‑
HA3
‑
HA4
‑
B；（12）将pOET5.1
‑
HA1
‑
HA2
‑
A和pOET5.1
‑
HA3
‑
HA4
‑
B进行目的基因的鉴定；（2）构建重组杆状病毒：将重组质粒DNA、flashBAC GOLD杆状病毒基因组DNA添加到TransIT
®
‑
Insect转染试剂中，混合均匀，18~30℃孵育5~30min，得转染络合物；将所述转染络合物滴入昆虫细胞Expisf9
‑
ZY，于27~28℃下，100~135rpm/min孵育培养24~120h，此时即为P0代重组杆状病毒；所述昆虫Expisf9
‑
ZY细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45248；（3）重组杆状病毒的培养：将P0代重组杆状病毒依次经过种子液培养和发酵培养进行增殖培养，得重组流感抗原蛋白收获液；（4）重组杆状病毒的纯化：将所述重组流感抗原蛋白收获液依次经核酸酶处理、样品浓缩与缓冲液置换处理、柱纯化层析、病毒灭活和过滤除菌，得重组流感HA抗原蛋白溶液；（5）半成品检测：将步骤（4）的重组流感HA抗原蛋白液进行杆状病毒和弹状病毒（N基因、P基因、M基因、G基因、X基因和L基因）检测，如未检出即为合成半成品；（6）鼻喷剂的制备：所述鼻喷剂包括如下组分，按重量分数计，HA抗原蛋白50~200份、壳聚糖0.01~0.3份、甘油0.01~0.5份、0.9%NaCl 0.1~0.5份和注射用水5~20份；制备方法为：将上述组分于5000~10000r/min，乳化3~10min，对乳化后的制剂产品进行无菌和物理性状检验；（7）分装处理：
对合格的产品灌装至鼻喷式疫苗瓶中，每瓶含5ml，使每瓶鼻喷式疫苗瓶中血凝素总量应在20~80mg范围，即得重组流感亚单位疫苗。3.如权利要求2所述的一种重组流感亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（11）中，在甲型H1N1病毒、甲型H3N2病毒、乙型Victoria系病毒和乙型Yamagata系病毒目的基因HA，均将编码的氨基酸的N端的原有信号肽替换为外源信号肽；所述外源信号肽为Melittin信号肽、GP64信号肽、HIV
‑
ENV信号肽中任选一种。4.如权利要求2所述的一种重组流感亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，重组质粒pOET5.1
‑
HA1
‑
HA2
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A和pOET5.1
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HA3
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HA4
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B按体积比0.1~1:0.1~1混合，且重组质粒DNA的总浓度达到0.1~70
µ
g。5.如权利要求2所述的一种重组流感亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）的具体操作为：（31）昆虫细胞Expisf9
‑
ZY复苏培养：从超低温冰箱中取出冻存的30~100ml冻存袋装的昆虫细胞Expisf9
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ZY置于自动干热式复苏仪上复苏，复苏仪参数设置为：23~30℃，5~10min；...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘金龙，高辉，李凤凯，仇艳平，李小美，张艳，
申请(专利权)人：天津中逸安健生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：