SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法技术方案

本发明专利技术公开了SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法，具体包括以下步骤：步骤一、资料研究；步骤二、优化截取；步骤三、载体构建；步骤四、表达纯化，本发明专利技术涉及分子病毒学技术领域。该SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法，通过将含有抗原决定簇的膜蛋白优化后亚克隆到昆虫杆状病毒表达载体pFastBacDUAL中，利用昆虫杆状病毒表达载体pFastBacDUAL的双表达载体特性，实现Gn蛋白和Gc蛋白的同时表达，构建同时表达Gn蛋白和Gc蛋白的pFastBacDUAL

【技术实现步骤摘要】
SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法


[0001]本专利技术涉及分子病毒学
，具体为SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法。

技术介绍

[0002]发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)是2009年以来在我国中东部农村地区引起发热伴血小板减少综合征(SFTS)的新发病毒性病原体，SFTS病死率高达10～15％，以SFTSV为代表的新发病毒正在世界蔓延，成为威胁人类健康的重要病毒病原。然而，目前对其致病机理的了解有限，尚无有效的疫苗或特效药物可供使用，研制安全有效的预防用疫苗是目前SFTSV迫切需要解决的问题，既往研究证实SFTSV的膜蛋白(Gn/Gc)上含有决定病毒与宿主细胞间相互作用的抗原决定簇，目前针对SFTSV重组糖蛋白Gn、Gc表达及其免疫效果评价的研究少见。
[0003]疫苗的发展经历了第一代传统疫苗、第二代重组疫苗及第三代核酸疫苗三个阶段，而针对SFTSV的疫苗研制亦在三方面展开：
[0004]1)传统疫苗是指由减毒的或灭活的病原微生物制得的、具有刺激机体产生针对病原微生物的特异抗体或者细胞免疫的生物制品，研究发现采用β
‑
丙内酯灭活、经超滤浓缩和分子筛层析后获得的纯化SFTSV，可诱导新西兰兔产生中和抗体和特异性病毒IgG抗体，然而传统疫苗往往不能同时满足安全性和高免疫原性的要求，例如，灭活疫苗进入人体后不能生长繁殖，对人体的刺激时间较短；减毒活疫苗需在低温条件下保存及运输，有效期相对短暂，存在毒力返祖的风险；
[0005]2)重组基因工程疫苗是利用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗，针对SFTSV的重组基因工程疫苗研究一直是各个研究单位的工作热点，Cao等人利用原核表达系统获得的重组NSs蛋白对C57BL/6J小鼠进行免疫接种，最终发现虽然重组的NSs蛋白可刺激小鼠产生高滴度的 anti
‑
NSs抗体，但未能有效的清除染毒小鼠体内的病毒，研究结果显示SFTSV 的Gn/Gc蛋白可以与C型凝集素DC
‑
SIGN受体结合进入到动物细胞内，同时 SFTSV的Gn还可以与非肌肉肌球蛋白重链IIA结合而进入感染细胞，这表明 SFTSV的糖蛋白与感染识别相关，研究证实人源单克隆抗体能够中和SFTSV对 Vero细胞的感染，该中和活性的实现可归因于SFTSV的Gn蛋白与细胞表面受体间的相互作用受到阻断，这表明Gn蛋白极有可能含有决定病毒与宿主细胞间相互作用的抗原决定簇，抗Gn蛋白特异性抗体是主要的中和抗体，与该研究结果一致，Gao等人亦发现Gn是理想的疫苗靶点，然而目前针对SFTSV重组糖蛋白Gn、Gc表达及其免疫效果评价的研究少见；
[0006]3)核酸疫苗是指将含有编码某种抗原蛋白基因序列的质粒载体或者基因序列作为疫苗，直接导入受试动物细胞内，通过宿主细胞的转录系统转录并翻译成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，从而使被接种者获得相应的免疫保护，南京医科大学研究团队发现用SFTSV Gn真核表达质粒免疫BALB/c小鼠，可诱导小鼠产生特异性IgG抗体。
[0007]为制备第二代疫苗，即重组疫苗，基于上述资料发现病毒的Gn\Gc上存在抗原决定簇，提示针对上述基因片段制备重组疫苗，有可能获得中和抗体。为此，特提出SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法，使用昆虫杆状病毒表达载体pFastBacDUAL，将Gn\Gc两个片段同时构建到该载体上，实现同时表达，大大提高了工作效率。

技术实现思路

[0008](一)解决的技术问题
[0009]针对现有技术的不足，本专利技术提供了SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法，解决了上述的问题。
[0010](二)技术方案
[0011]为实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案：SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法，具体包括以下步骤：
[0012]步骤一、资料研究：对发热伴血小板减少综合征病毒SFTSV的基因序列进行资料查询和分析，发现发热伴血小板减少综合征病毒SFTSV的基因序列的膜蛋白中存在跨膜结构域，并且跨膜结构域中含有决定病毒与宿主细胞间相互作用的抗原决定簇；
[0013]步骤二、优化截取：对步骤一中发现的发热伴血小板减少综合征病毒 SFTSV的基因序列进行密码子优化后进行基因合成，随后截取合成后基因序列中的膜蛋白序列，作为目的片段；
[0014]步骤三、载体构建：将步骤二中截取的目的片段亚克隆到pFastBacDUAL 载体中，其中Gn蛋白插入到BamHI/Not I位点，Gc蛋白插入到Nco I/Nhe I 位点，转至步骤四；
[0015]步骤四、表达纯化：利用昆虫系统对完成步骤三Gn蛋白和Gc蛋白插入后的pFastBacDUAL载体进行目的蛋白表达，随后进行表达纯化测试。
[0016]通过采用上述技术方案，将含有抗原决定簇的膜蛋白优化后亚克隆到昆虫杆状病毒表达载体pFastBacDUAL中，利用昆虫杆状病毒表达载体 pFastBacDUAL的双表达载体特性，实现Gn蛋白和Gc蛋白的同时表达，构建同时表达Gn蛋白和Gc蛋白的pFastBacDUAL
‑
Gn/Gc，获得针对病毒膜蛋白的重组基因工程疫苗，为病毒防控提供思路。
[0017]本专利技术进一步设置为：所述步骤一中发热伴血小板减少综合征病毒SFTSV 的基因序列的Gn蛋白和Gc蛋白中存在跨膜结构域。
[0018]本专利技术进一步设置为：所述步骤二中截取合成后基因序列中的Gn蛋白和 Gc蛋白序列，且步骤二中密码子优化具体过程包括使用同义密码子代替稀有密码子。
[0019]本专利技术进一步设置为：所述步骤三中的亚克隆步骤为：在pFastBacDUAL 载体的BamHI/Not I位点上插入Gn蛋白，随后，将Gc蛋白插入到pFastBacDUAL 载体Nco I/Nhe I位点，完成目的片段和pFastBacDUAL载体的连接，得到对应的连接产物，再进行重组子筛选。
[0020]本专利技术进一步设置为：所述步骤三中Gn蛋白插入到BamHI/Not I位点后，在C端添加Strep标签。
[0021]本专利技术进一步设置为：所述步骤三中Gc蛋白插入到Nco I/Nhe I位点后，在N端添加His标签。
[0022]通过采用上述技术方案，将病毒膜蛋白的两个基因片段构建在一个 pFastBacDUAL双表达载体上，实现两个蛋白的同时表达，并且通过设计不同标签的方式，方
便后期对两个蛋白分别进行纯化，为后续评估两个蛋白的功能提供了便利。
[0023](三)有益效果
[0024]本专利技术提供了SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法。具备以下
[0025]有益效果：
[0026](1)该SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法，通过将含有抗原决定簇的膜蛋白优化后亚克隆到昆虫杆状病本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤：步骤一、资料研究：对发热伴血小板减少综合征病毒SFTSV的基因序列进行资料查询和分析，发现发热伴血小板减少综合征病毒SFTSV的基因序列的膜蛋白中存在跨膜结构域，并且跨膜结构域中含有决定病毒与宿主细胞间相互作用的抗原决定簇；步骤二、优化截取：对步骤一中发现的发热伴血小板减少综合征病毒SFTSV的基因序列进行密码子优化后进行基因合成，随后截取合成后基因序列中的膜蛋白序列，作为目的片段；步骤三、载体构建：将步骤二中截取的目的片段亚克隆到pFastBacDUAL载体中，其中Gn蛋白插入到BamHI/Not I位点，Gc蛋白插入到Nco I/Nhe I位点，转至步骤四；步骤四、表达纯化：利用昆虫系统对完成步骤三Gn蛋白和Gc蛋白插入后的pFastBacDUAL载体进行目的蛋白表达，随后进行表达纯化测试。2.根据权利要求1所述的SFTSV膜蛋白杆状病毒表达系统载体构建方法，其特征在于：所述步骤一中发热伴血小板减少综合征病毒SFTSV的基因序列的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘苗苗，
申请(专利权)人：济宁医学院，
类型：发明
国别省市：