流感病毒疫苗及其用途制造技术

本文提供了流感血凝素茎部多肽、编码所述多肽的核酸、包含所述核酸的载体以及包含它们的药物组合物，以及它们的使用方法，特别是在预防和/或治疗流感病毒感染中的使用方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】流感病毒疫苗及其用途引言本专利技术涉及医学领域。本文提供了甲型流感血凝素(HA)茎部结构域多肽、编码所述多肽的核酸、包含所述多肽的药物组合物及其使用方法。
技术介绍
流感病毒是主要的人病原体，引起呼吸系统疾病(通常称为“流行性感冒”或“流感”)，其严重性范围为从亚临床感染至可导致死亡的原发性病毒性肺炎。感染的临床效应随流感株系的毒力以及宿主的暴露、病史、年龄和免疫状态而变。据估计每年世界范围内有约10亿人经历流感病毒感染，导致3百万至5百万例严重疾病，并且估计有300,000至500,000例流感相关死亡。这些感染大多数可以归因于携带H1或H3血凝素亚型的甲型流感病毒，较小贡献来自乙型流感病毒，因此在季节性疫苗中通常包括这些的代表。当前的免疫实践依赖于流行的流感病毒的早期鉴定以允许及时生产有效的季节性流感疫苗。除了在预测将在下一季节期间占主导的株系方面的固有困难以外，抗病毒抗性和免疫逃逸也在当前疫苗预防发病和死亡的失效中起作用。另外，由源自动物宿主并重配以增加人-人传播的高毒力病毒株系引起大范围流行病的可能性也仍然对全球健康造成严重且现实的威胁。流感病毒是属于正粘病毒科的包膜RNA病毒。其基因组由八个单链RNA区段组成，这些单链RNA区段编码11种不同的蛋白质：一种核蛋白(NP)、三种聚合酶蛋白(PA、PB1和PB2)、两种基质蛋白(M1和M2)、三种非结构蛋白(NS1、NS2和PB1-F2)以及两种外部糖蛋白-血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。甲型流感病毒在自然界中分布广泛，并且可以感染多种鸟类和哺乳动物。这些病毒是基于HA和NA蛋白的抗原结构的差异来分类的，其不同组合代表独特的病毒亚型，这些病毒亚型进一步分类为具体的流感病毒株系。虽然所有已知亚型都可以在鸟类中发现，但是当前流行的人甲型流感亚型是H1N1和H3N2。甲型流感病毒的系统发育分析表明，血凝素细分为两个主要的所谓系统发育类别：尤其是在系统发育类别1(1类病毒)中的H1、H2、H5和H9亚型，以及尤其是在系统发育类别2(2类病毒)中的H3、H4和H7亚型。乙型流感病毒株系严格地是人株系。乙型流感病毒株系内HA中的抗原变异小于在甲型株系内观察到的那些。乙型流感病毒的两种遗传性和抗原性不同的谱系在人体中循环，以B/山形/16/88(也称为B/山形)和B/维多利亚/2/87(B/维多利亚)谱系为代表。虽然由乙型流感病毒引起的疾病谱通常轻于由甲型流感病毒引起的疾病谱，但是对于乙型流感病毒感染仍经常观察到需要住院的严重疾病。已知中和流感病毒的抗体主要针对血凝素(HA)。血凝素或HA是一种三聚体糖蛋白，该三聚体糖蛋白锚定在病毒膜中并且具有双重功能：它负责与细胞表面受体唾液酸结合，并且在吸收后，它介导病毒膜和内体膜的融合，从而导致病毒RNA释放到靶细胞的细胞溶质中。HA包括较大的头部结构域和较小的茎部结构域。茎部结构域通过C-末端跨膜结构域序列锚定到病毒膜中。该蛋白经翻译后裂解，产生两个HA多肽，HA1和HA2(完整序列称为HA0)(图1A)。膜远端头部区域主要源自HA1，而膜近端茎部区域主要源自HA2。需要裂解HA前体分子HA0来激活病毒的感染性，并且活化蛋白酶在宿主中的分布是流感病毒致病性的决定因素之一。哺乳动物和非致病性禽病毒的HA在细胞外裂解，这限制了它们在宿主中向遇到适当蛋白酶的组织的扩散。另一方面，致病性病毒的HA被普遍存在的蛋白酶在细胞内裂解，因此具有感染多种细胞类型并引起全身感染的能力。季节性流感疫苗必须每年更新的原因是该病毒的变异性很大。在HA蛋白中，这种变异特别表现在头部结构域中，在头部结构域中，抗原性漂移和转变产生大量不同的变体。由于这也是免疫显性区域，因此大多数中和抗体都针对该结构域，并通过干扰受体结合而起作用。头部结构域的免疫显性和较大变异的组合解释了感染特定株系不会对其他株系产生免疫的原因：首次感染引发的抗体只能识别有限数量的与首次感染的病毒密切相关的株系。近来，缺乏完整的流感血凝素球状头部结构域或其实质部分的流感血凝素茎部多肽已有描述，并且已经用于产生针对该茎部结构域多肽的一个或多个保守表位的免疫应答。据信，茎部多肽的表位的免疫原性低于球状头部结构域的高免疫原性区域，并且茎部多肽中不存在球状头部结构域可能允许发展针对茎部多肽的一个或多个表位的免疫应答(Steel等人，2010)。因此，Steel等人通过使A/波多黎各/8/1934(H1N1)和A/香港/1968(H3N2)株系的HA1结构域缺失氨基酸残基53至276，并用较短的柔性连接序列GGGG替换该缺失序列，产生了流感HA茎部多肽。小鼠接种H3HK68构建体不会引发与1类HA交叉反应的抗血清。另外，如WO2013/079473中所示，茎部多肽是不稳定的并且未采用如缺乏抗体的结合所证明的正确构象，这些抗体经证实可以与茎部区域中的保守表位结合。Bommakanti等人(2010)描述了一种基于HA2的多肽，该多肽包含氨基酸残基330-501(HA2)、7-氨基酸接头(GSAGSAG)、HA1的氨基酸残基16-55、6-氨基酸接头GSAGSA，随后是HA1的残基290-321，在HA1中具有突变V297T、I300E、Y302T和C305T。该设计基于H3HA(A/香港/1968)的序列。该多肽仅针对H3亚型(A/Phil/2/82)内的另一种流感病毒株系而不针对H1亚型(A/PR/8/34)提供交叉保护作用。在Bommakanti等人(2012)的最新论文中，描述了基于来自H1N1A/波多黎各/8/1934(H1HA0HA6)的HA的茎部多肽。在这种多肽中，氨基酸残基48至288的等效物已经缺失，并且产生了突变I297T、V300T、I302N、C305S、F392D、F395T和L402D。基于H3和H1两者的多肽均在大肠杆菌(E.coli)中表达，因此缺乏作为天然存在的HA蛋白的一部分的聚糖。最近，Lu等人(2014)还描述了源自H1N1A/加利福尼亚/05/2009的HA的可溶性茎部多肽。在最终设计中，氨基酸残基52至277缺失(也不存在前导序列)，并且在该蛋白质的B环中引入了两个突变，即F392D和L402D。此外，该多肽含有C-末端三聚结构域(折叠子(foldon))。另外，引入了两个单体间二硫桥，一个在三聚体折叠子结构域的区域中，一个在位置416和417处(即H3编号中的G416C和F417C)。该多肽是在基于大肠杆菌的无细胞系统中产生的(因此其缺乏作为天然存在的HA蛋白的一部分的聚糖)，并以变性形式回收，使用前需要再折叠。经再折叠的蛋白无法结合正与保守构象茎部表位结合的广泛中和抗体(bnAb)CR6261。没有示出来自流感攻击的免疫学数据或保护数据。在另一篇论文中，Mallajosyula等人(2014)也描述了流感HA茎部多肽。在这种设计中，基于来自H1N1A/波多黎各/8/1934的HA，不但大部分HA1序列缺失(残基48至289，H3编号)，而且HA2的大部分N-末端和C-末端序列也缺失(分别为残基323至369和443至末端)。该多肽在C-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种1类甲型流感血凝素(HA)茎部多肽，其包含HA1和HA2结构域，所述HA茎部多肽包含的氨基酸序列包含：/n(i)该HA1结构域中头部区域的缺失；/n(ii)该HA2结构域中三聚区域的修饰；/n(iii)至少2个形成单体内二硫桥的半胱氨酸残基；/n(iv)至少2个形成单体间二硫桥的半胱氨酸残基；/n其中与位置392处的氨基酸相对应的氨基酸是P、R或Y，优选P或R，并且与位置434处的氨基酸相对应的氨基酸是Q，并且其中这些氨基酸位置的编号基于Winter等人(1981)中使用的H3编号。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180123 EP 18152991.81.一种1类甲型流感血凝素(HA)茎部多肽，其包含HA1和HA2结构域，所述HA茎部多肽包含的氨基酸序列包含：
(i)该HA1结构域中头部区域的缺失；
(ii)该HA2结构域中三聚区域的修饰；
(iii)至少2个形成单体内二硫桥的半胱氨酸残基；
(iv)至少2个形成单体间二硫桥的半胱氨酸残基；
其中与位置392处的氨基酸相对应的氨基酸是P、R或Y，优选P或R，并且与位置434处的氨基酸相对应的氨基酸是Q，并且其中这些氨基酸位置的编号基于Winter等人(1981)中使用的H3编号。


2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述茎部多肽包含氨基酸序列，该氨基酸序列包含：
(i)该HA1结构域中头部区域的缺失，所述缺失至少包含从与位置53处的氨基酸相对应的氨基酸直到并且包括与位置302处的氨基酸相对应的氨基酸的氨基酸序列；
(ii)该HA2结构域中三聚区域的修饰，优选C-螺旋中该三聚区域的修饰，所述三聚区域包含从与位置405处的氨基酸相对应的氨基酸直到并且包括与位置419处的氨基酸相对应的氨基酸的氨基酸序列；
(iii)在与位置310相对应的氨基酸位置处的半胱氨酸和在与位置422相对应的位置处的半胱氨酸；
(iv)在与位置397相对应的位置处的半胱氨酸结合在与位置405相对应的位置处的半胱氨酸；或在与位置396相对应的位置处的半胱氨酸结合在与位置408相对应的位置处的半胱氨酸；或在与位置399相对应的位置处的半胱氨酸结合在位置405处的半胱氨酸；
其中在与位置392相对应的位置处的氨基酸是P、R或Y，优选P或R，并且其中在与位置434相对应的位置处的氨基酸是Q。


3.根据权利要求1或2所述的多肽，其中在该HA1结构域中的缺失至少包含从位置47处的氨基酸直到并且包括位置306处的氨基酸的氨基酸序列。


4.根据权利要求1、2或3所述的多肽，其中该三聚结构域的修饰包括在该C-螺旋中引入异源三聚结构域。


5.根据权利要求4所述的多肽，其中该异源三聚结构域是GCN4序列。


6.根据权利要求1、2或3所述的多肽，其中该三聚结构域的修饰包括对该C-螺旋中的七肽重复序列的优化。


7.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，其中与氨基酸392相对应的氨基酸是Y、P或R，与位置434处的氨基酸相对应的氨基酸是Q，并且与位置442相对应的位置处的氨基酸是A。


8.根据前述权利要求中任一项所述的多肽，该多肽包含在与位置397相对应的位置处的半胱氨酸结合在与位置405相对应的位置处的半胱氨酸。

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【专利技术属性】
技术研发人员：F·J·麦尔德，T·里切尔，B·勃兰登堡，M·A·C·容格尼伦，D·特鲁安，J·P·M·朗格戴克，
申请(专利权)人：扬森疫苗与预防公司，
类型：发明
国别省市：荷兰;NL