通过定量质谱法校准用于临床抗体响应的ELISA制造技术

本发明专利技术描述了校准用于临床抗体响应的ELISA读出的方法。特别地，本发明专利技术涉及用于通过定量质谱法校准用于针对疫苗的临床抗体响应的ELISA读出的方法。的ELISA读出的方法。的ELISA读出的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过定量质谱法校准用于临床抗体响应的ELISA


[0001]本专利技术涉及校准用于临床抗体响应的ELISA读出的方法。特别地，本专利技术涉及用于通过定量质谱法校准用于针对疫苗的临床抗体响应的ELISA读出的方法。

技术介绍

[0002]目前，基于与用于免疫测定(诸如ELISA)的病毒反应性血清的参考材料的比较，通过具有任意单位的读出的免疫测定来分析在临床试验期间对疫苗产品的初次免疫应答(Aydin 2015)。尽管这种类型的读出给出了足够的信息来比较不同参与者的免疫应答以及同一临床研究内各组间的免疫应答，但是它没有给出关于免疫应答的量级的信息。正因为如此，当不使用完全相同的测定和参考材料时，不可能精确地比较各种疫苗产品之间、跨不同靶抗原的免疫应答，或将临床数据与临床前数据进行比较。
[0003]对于这种类型的ELISA，没有实际的可能性摆脱免疫测定而使用定量质谱法作为人血清中抗原特异性抗体的读出，因为定量质谱不能区分人血清中的抗原特异性抗体和其他抗体。
[0004]与可在循环中直接测量活性药剂的治疗剂相比，疫苗的药效学响应基于免疫系统对免疫原的响应。可以许多独特方式结合至靶抗原的多克隆血清样品中的疫苗特异性抗体的浓度不能相对于基于具有一致结合化学计量和亲和力的单克隆抗体的参考标准可靠地评估。基于来源于自然感染或通过疫苗接种的人群的多克隆血清的参考标准将含有可变浓度的一系列抗体特异性，并且是评价疫苗响应的合适参考。
[0005]可以使用定量质谱法来校准临床免疫测定(Pan,Aebersold等人，2009)，从而使得测定的读出为以IgG/IgA/ml血清为单位的绝对量。这将给出对疫苗的临床响应的实际量级，并且将进一步使得能够将其与对针对相同病毒的其他疫苗产品的响应进行比较。此外，这将使得能够将临床数据与临床前数据进行比较。
[0006]然而，还没有报道过能够使用质谱法对疫苗引发的免疫应答进行绝对校准。尽管存在大量关于建立免疫应答的绝对读出的现有技术参考文献，但其依赖于建立可在实验室中广泛实施的公认标准、使用具有已知浓度的纯化抗体作为参考标准、或对抗体进行免疫纯化随后直接定量。
[0007]由于ELISA具有极高的特异性、高通量、简单性、监管可接受性，其是测量临床样品中免疫应答的最优选的检测方法，并且是用于测量抗原特异性抗体目的的唯一实用的解决方案。因此，需要开发上述两种技术ELISA和定量质谱法(qMS)的新组合。

技术实现思路

[0008]本专利技术通过用定量质谱法校准临床抗体响应的ELISA读出来满足这种需要，该定量质谱法允许将ELISA的任意读出转换为抗原特异性抗体的绝对量。本专利技术组合了两种众所周知的技术，ELISA和定量质谱法(qMS)，以这种方式使得临床分析的主力军ELISA可以与qMS的所有优势一起使用，即，绝对免疫球蛋白读出(Calder
ó
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Celis,Encinar等人，2018)。
因此，通过使用qMS来定量ELISA参考材料的响应，可以将ELISA的任意读出转换为免疫球蛋白的绝对量。
[0009]在一个总的方面，本申请涉及一种确定样品中特异于抗原的抗体的绝对量的方法。
[0010]在一些实施方案中，该方法包括：
[0011]i.使含有该抗体的校准材料与该抗原接触，以形成包含该抗原和结合至该抗原的该抗体的一种或多种蛋白复合物；
[0012]ii.通过ELISA检测方法确定校准材料中该抗体的相对量；
[0013]iii.通过使校准材料与该抗原接触以形成包含该抗原和结合至该抗原的该抗体的一种或多种蛋白复合物来重复步骤i；
[0014]iv.分离该一种或多种蛋白复合物；
[0015]v.消化该一种或多种蛋白复合物，以生成包含该抗体的蛋白特征性肽(proteotypic peptide)的混合物；
[0016]vi.使该混合物经历定量质谱法，以测量该蛋白特征性肽的质量响应；
[0017]vii.通过将该蛋白特征性肽的质量响应与该蛋白特征性肽的参考曲线进行比较来确定校准材料中该抗体的绝对量；
[0018]viii.建立转换因子以将步骤ii中通过ELISA确定的校准材料中该抗体的相对量与步骤vii中确定的校准材料中该抗体的绝对量联系起来；以及
[0019]ix.应用该转换因子以确定该样品中该抗体的绝对量。
[0020]在一些实施方案中，该方法还包括在步骤i之前获得该蛋白特征性肽的参考曲线，其中该参考曲线将该蛋白特征性肽的质量响应与该蛋白特征性肽的绝对量联系起来。
[0021]在一些实施方案中，在步骤vii中，首先通过将该蛋白特征性肽的质量响应与该蛋白特征性肽的参考曲线进行比较来确定该蛋白特征性肽的绝对量，然后基于该蛋白特征性肽的绝对量确定该校准材料中该抗体的绝对量。
[0022]在一些实施方案中，该方法还包括：
[0023]x.使样品与该抗原接触，以形成包含该抗原和结合至该抗原的该抗体的一种或多种蛋白复合物；
[0024]xi.通过ELISA检测方法确定该样品中该抗体的相对量；以及
[0025]xii.通过应用步骤viii中建立的该转换因子，确定该样品中该抗体的绝对量。
[0026]在一些实施方案中，样品是从施用了包含该抗原或来自相同病毒的相关抗原的疫苗的受试者获得的样品，或从已经与包含该抗原的病毒或抗原相关病毒接触过的受试者获得的样品。
[0027]在一些实施方案中，疫苗是预防性疫苗或治疗性疫苗，优选针对呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗、针对人免疫缺陷病毒(HIV)的疫苗、针对流感病毒的疫苗、针对埃博拉病毒的疫苗、针对A型、B型、C型或D型肝炎病毒的疫苗、或针对SARS
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COV
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2的疫苗。
[0028]在某些实施方案中，抗原是RSV
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B抗原，优选RSV
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B F抗原。
[0029]在某些实施方案中，抗原是HIV抗原，优选Mosaic gp140。
[0030]在某些实施方案中，抗原是SARS
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COV
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2抗原，优选刺突抗原(SARS
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COV
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2S)。
[0031]在一些实施方案中，样品中的抗体结合至抗原的相同或不同表位。
[0032]在一些实施方案中，抗体包括免疫球蛋白G(IgG)(诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)中的一种或多种。
[0033]在一些实施方案中，样品是血清、血浆或另一种生物流体样品，优选人血清。
[0034]在一些实施方案中，校准材料是血清、血浆或另一种生物流体样品，优选人血清。
[0035]在一些实施方案中，样品中的抗体结合至被用作校准材料的抗原的相同或不同表位。
[0036]在一些实施方案中，步骤v还包括对该一种或多种蛋白复合物进行变性、还原、烷基本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种确定样品中特异于抗原的抗体的绝对量的方法，所述方法包括：i.使含有所述抗体的校准材料与所述抗原接触，以形成包含所述抗原和结合至所述抗原的所述抗体的一种或多种蛋白复合物；ii.通过ELISA检测方法确定所述校准材料中所述抗体的相对量；iii.通过使所述校准材料与所述抗原接触以形成包含所述抗原和结合至所述抗原的所述抗体的一种或多种蛋白复合物来重复步骤i；iv.分离所述一种或多种蛋白复合物；v.消化所述一种或多种蛋白复合物，以生成包含所述抗体的蛋白特征性肽的混合物，其中所述蛋白特征性肽存在于所述抗体的Fc区中；vi.使所述混合物经历定量质谱法，以测量所述蛋白特征性肽的质量响应；vii.通过将所述蛋白特征性肽的质量响应与所述蛋白特征性肽的参考曲线进行比较来确定所述校准材料中所述抗体的绝对量，其中所述参考曲线将所述蛋白特征性肽的质量响应与所述蛋白特征性肽的绝对量联系起来；viii.建立转换因子以将步骤ii中通过ELISA确定的所述校准材料中所述抗体的相对量与步骤vii中确定的所述校准材料中所述抗体的绝对量联系起来；ix.使所述样品与所述抗原接触，以形成包含所述抗原和结合至所述抗原的所述抗体的一种或多种蛋白复合物；x.通过ELISA检测方法确定所述样品中所述抗体的相对量；以及xi.应用所述转换因子以确定所述样品中所述抗体的绝对量。2.根据权利要求1所述的方法，还包括在步骤i之前获得所述蛋白特征性肽的所述参考曲线。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤vii中，首先通过将所述蛋白特征性肽的质量响应与所述蛋白特征性肽的所述参考曲线进行比较来确定所述蛋白特征性肽的绝对量，然后基于所述蛋白特征性肽的绝对量确定所述校准材料中所述抗体的绝对量。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述样品是从施用了包含所述抗原或来自相同病毒的相关抗原的疫苗的受试者获得的样品，或是从已经与包含所述抗原的病毒接触过的受试者获得的样品。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述疫苗是预防性疫苗或治疗性疫苗，优选针对呼吸道合胞病毒(RSV)的疫苗、针对人免疫缺陷病毒(HIV)的疫苗、针对流感病毒的疫苗、针对埃博拉病毒的疫苗、针对A型、B型、C型或D型肝炎病毒的疫苗、或针对SARS
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COV
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2的疫苗。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述抗原是RSV
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B F抗原。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述样品中的所述抗体结合至所述抗原的相同或不同表位。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述抗体包括免疫球蛋白G(IgG)中的一种或多种。9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述样品是血清、血浆或另一种生物流体样品。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述校准材料是血清、血浆或另一种生物流体样品。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述步骤v还包括对所述一种或多种蛋白复合物进行变性、还原、烷基化和/或稀释的一个或多个步骤。12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述抗体包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的一种或多种。13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述蛋白特征性肽包含SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的氨基酸序列。14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，还包括在步骤vi之前使所述混合物经历液相色谱法(LC)，优选地所述LC是高效液相色谱法(HPLC)。15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述定量质谱法是串联质谱法。16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述定量质谱法包括多重反应监测(MRM)或选择反应监测(SRM)。17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述定量质谱法包括平行反应监测(PRM)。18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，还包括测量所述蛋白特征性肽的所述完整质量的质量响应。19.根据权利要求18所述的方法，还包括将所述蛋白特征性肽的所述完整质量的质量响应与所述蛋白特征性肽的所述参考曲线进行比较。20.一种确定样品中特异于RSV抗原的抗体的绝对量的方法，所述样品来自施用了包含所述RSV抗原的疫苗的受试者，所述方法包括：i.使所述样品与所述RSV抗原接触，以形成包含所述RSV抗原和结合至所述抗原的所述抗体的一种或多种蛋白复合物；ii.分离所述一种或多种蛋白复合物；iii.消化所述一种或多种蛋白复合物以生成第一混合物，所述第一混合物包含具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列的蛋白特征性肽；iv.使所述第一混合物经历液相色谱法(LC)，优选高效液相色谱法(HPLC)，以生成第二混合物；v.使所述第二混合物经历定量质谱法，以由此生成所述蛋白特征性肽的质谱；vi.从所述质谱测量所述蛋白特征性肽的质量响应；以及vii.通过将所述蛋白特征性肽的质量响应与所述蛋白特征性肽的参考曲线进行比较来确定所述样品中特异于所述RSV抗原的所述抗体的绝对量，其中所述参考曲线将所述蛋白特征性肽的质谱响应与所述蛋白特征性肽的绝对量联系起来。21.根据权利要求20所述的方法，还包括在步骤i之前获得所述蛋白特征性肽的所述参考曲线。22.根据权利要求20或21所述的方法，其中在步骤vii中，首先通过将所述蛋白特征性肽的质量响应与所述蛋白特征性肽的所述参考曲线进行比较来确定所述蛋白特征性肽的绝对量，然后基于所述蛋白特征性肽的绝对量确定特异于所述RSV抗原的所述抗体的绝对量。23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述定量质谱法是串联质谱法。24.根据权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述定量质谱法包括多重反应监
测(MRM)、选择反应监测(SRM)或平行反应监测(PRM)。25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，还包括测量所述蛋白特征性肽的完整质量的质量响应。26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，还包括将所述蛋白特征性肽的完整质量的质量响应与所述蛋白特征性肽的所述参考曲线进行比...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：扬森疫苗与预防公司，
类型：发明
国别省市：