一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法，基于一种凝集素包被磁珠，利用亲和层析法从血清中将CDT与转铁蛋白分离。该方法操作简单、投入成本低、易得到高纯度CDT等优点，为后续检测提供优质原料。同时本发明专利技术提供了一种无需分离即可检测糖链转铁蛋白，从而得到CDT含量及占比的方法，发明专利技术中使用转铁蛋白单克隆捕获抗体A可以特异性识别总转铁蛋白，快速从血清中分离转铁蛋白。发明专利技术中使用的微球是一种磁性微球，微球比表面积大与转铁蛋白充分接触，增加相互碰撞的机会，结合更多蛋白，提高监测范围；磁珠被磁力架固定在离心管壁，通常两分钟内即可完成吸磁，不需要离心且换液过程中不用担心损失样品，操作简单，提高效率。提高效率。提高效率。

【技术实现步骤摘要】
一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法


[0001]本专利技术涉及一种检测糖缺失性转铁蛋白的方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是常见的肝脏疾病之一，长期大量饮酒导致的中毒性肝损伤甚至肝功能衰竭严重危害人民健康。研究表明，全球有5.1％的疾病是由于酒精消耗引起的，有害饮酒每年导致330万人死亡；和不饮酒的人群比较，慢性酒精中毒者上消化道手术后血液循环白介素(IL)
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10明显增加，IL
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6/IL
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10比值显著降低，同时伴随免疫功能发生一系列改变，导致慢性酒精中毒者在上消化道手术后恢复的时间明显长于不饮酒的人群，伤口感染和肺炎的发生率也明显增加。2001年美国食品和药品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准糖缺失性转铁蛋白(carbohydrate deficient transferrin,CDT)作为一项用于评估饮酒状况的标志物应用于临床。相对于其他肝脏酶类标志物，CDT本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、将稀释样本加入到转铁蛋白单克隆捕获抗体A包被磁珠复合物体系中，涡旋抗体A包被磁珠，抗体A包被磁珠在样本溶液中均匀分布，室温下孵育30
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60min，保证磁珠与转铁蛋白充分结合；步骤二、体系平衡后，加磁场固定磁珠，固液分离，加入清洗缓冲液清洗免疫磁珠，将清洗磁珠用反应缓冲液重悬，涡旋混匀。步骤三、将步骤二的重悬磁珠分别加入生物素化凝集素或生物素化检测抗体B；经过充分混匀孵育，经固液分离，重悬免疫磁珠；步骤四、加入亲和素标记的碱性磷酸酶或辣根过氧化酶，然后加入底物液进行显色反应或发光反应，测定总转铁蛋白以及含有唾液酸糖链的转铁蛋白，经过数据计算，准确获得糖缺失转铁蛋白CDT含量以及CDT占比；或者采用以下步骤：步骤(1)将凝集素包被的磁珠与含有CDT以及唾液酸糖链转铁蛋白的样本混合，搅拌均匀，室温下孵育10
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30min，使磁珠在溶液中均匀分布，保证磁珠与转铁蛋白充分结合；步骤(2)利用磁力架加磁场固定磁珠，固液分离，将CDT与转铁蛋白分离，收集液体样本即糖缺失性转铁蛋白CDT，利用收集到的糖缺失性转铁蛋白CDT，可以直接检测含量以及计算其占比。2.根据权利要求1所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，步骤(1)中凝集素包被磁珠的制备方法，包括以下步骤：1)将一定浓度的活化剂加入到带有羧基磁珠中，旋转混匀活化微球30
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60min，磁力架分离，收集磁珠；2)用2
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5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2
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3次，然后用反应缓冲液重悬磁珠；3)将一定量的凝集素加入到活化磁珠溶液内，室温下旋转震荡4
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6h或4℃过夜使凝集素与磁珠充分结合，磁力架固液分离，收集偶联磁珠；4)用2
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5倍体积的反应缓冲液清洗磁珠2
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3次，加入封闭缓冲液，旋转混合1
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3h，用以封闭磁珠多余的活性位点，磁分离，收集磁珠；5)用保存缓冲液清洗磁珠，最后用保存缓冲液重悬凝集素包被的磁珠。3.根据权利要求2所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，反应缓冲液为pH4
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9、50
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100mM的MES或者pH4
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9、100mM的PBS，优选MES；所述的凝集素为特异性结合Siaa2—6Galβ1—4GlcNAc糖链的凝集素，优选TJA
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1、SNA或Allo
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a，更优选SNA；所述的封闭缓冲液为50
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100mM的乙醇胺、1％的BSA或Tris溶液，优选BSA；所述的保存缓冲液为含有0.5％BSA、0.1％Tween20 pH7.4的PBS；所述的活化剂为NHS、EDC或戊二醛，优选NHS和EDC。4.根据权利要求2所述的一种检测糖缺失转铁蛋白的方法，其特征在于，羧基磁珠为MS300/Carboxyl或MS160/Carboxyl，MS300/Carboxyl的粒径为3um，羧基含量为10nmol/mg；MS160/Carbox...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐玉超，隗勇，李金文，李晓云，
申请(专利权)人：中金进出口有限公司中科梅奥山东医学检验有限公司中拓医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：