一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法及其制品技术

本发明专利技术涉及一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法及其制品，所述方法包括将贴壁的MDCK细胞驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系，然后接毒增殖，分离收集病毒液，灭活，添加佐剂配制成疫苗。本发明专利技术用细胞系代替鸡胚组织培养制造禽流感病毒以及禽流感疫苗，可解决鸡胚自身及受外源病毒污染的问题，通过原材料和培养条件的严格控制，保证生产出来的疫苗纯粹，确保了疫苗的安全性，可在安全、经济的条件下应用于大规模生产，获得高纯度、工业产率理想的有效禽流感疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法及其制品
本专利技术涉及疫苗制备
，具体涉及一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法及其制品。
技术介绍
禽流感(BirdFlu或AvianInfluenza)是由甲型流感病毒的亚型(也称禽流感病毒)引起的一种急性传染病，严重威胁养殖业和人类健康，并给国民经济带来巨大损失。目前为止，禽流感仍未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疫病发生和流行的最有效手段。用于禽流感疫苗制备的传统鸡胚工艺存在诸多问题，生产周期长、操作繁琐、工作量大，收获病毒液后，还需对剩余鸡胚进行无害化处理，易于感染禽源外源病毒，产生生物安全隐患。如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应还会存在很大问题。以细胞作为介质是目前疫苗制备的趋势，犬肾(Madin-Darbycaninekidneycells，MDCK)细胞由Madin和Darby分离培育建立，培养容易、增殖快、流感病毒感染效率高，是国内外公认的最适合禽流感病毒培养的细胞系。其通常是以贴壁培养生长，细胞之间互相衔接或呈镶嵌状排列，并会在表面集合形成紧密的连接蛋白，从而形成单层贴壁细胞。但是，该培养方式存在一些缺陷，比如贴壁培养受基质表面积限制导致病毒产量下降；贴壁培养过程中换液等程序较为复杂繁琐，血清的使用易受微生物、病毒和支原体等的污染，无血清培养技术是阐明细胞生成、增殖、分化以及基因表达调控的基础问题的有效工具，但即使无血清贴壁培养也只适用于试验研究，不适用于大规模培养，不能满足病毒疫苗等实际生产需要。因此，如何将MDCK细胞系作为种细胞高效培养禽流感病毒，进而获得禽流感疫苗，是一项值得技术人员深入研究和解决的技术问题。同时，疫苗质量取决于病毒抗原含量，细胞的高感染率是实现病毒增殖的前提。因此，寻找一种细胞培养方法能够生产出高滴度的病毒，满足免疫生产要求，在发生疫情时能够快速提供疫苗，显得迫在眉睫。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术存在的不足之处，提供一种应用生物反应器培养悬浮细胞生产禽流感病毒以及制备禽流感疫苗的方法。该方法用来生产的禽流感病毒不仅产毒高效稳定，病毒血细胞凝集效价高，而且可以大量降低生产成本，不会受制于原料供应，占用场地小，自动化程度高，易于快速扩大生产规模，显著提高疫苗产量和质量。为达到上述目的，本专利技术采取了如下的技术方案：一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法，包括如下步骤：(1)细胞培养：复苏培养贴壁的MDCK细胞，待细胞生长至致密单层后，消化传代；逐步减少FBS比例直至0％；摇床扩大培养，直至驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系；接种于生物反应器，完成初级细胞培养；(2)病毒接种：将鸡胚繁殖的禽流感病毒液接种至致密单层的贴壁MDCK细胞，获得悬浮MDCK细胞培养用种毒；取上述禽流感病毒种毒接种于悬浮MDCK细胞，进行培养；(3)收集病毒液：分离收获病毒液；(4)病毒灭活：采用化学试剂灭活病毒；(5)纯化病毒液：采用离心或澄清膜处理病毒液，去除杂质碎片；进一步采用柱层析法纯化病毒液；(6)疫苗配制：添加佐剂将病毒液配制成疫苗形式。进一步的，所述细胞种毒的病原类型为禽流感H5N1亚型或H9N1亚型。优选的，一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法，包括如下步骤：(1)细胞培养：将DMEM、F12和RPMI1640按照一定比例进行混合均匀，以此为基础培养基并添加10％FBS，复苏培养贴壁的MDCK细胞，待细胞生长至致密单层后，0.25％EDTA-胰酶消化，传代5次；逐步减少含10％FBS的DMEM-F12-RPMI1640培养基比例、增加无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基比例，使血清含量逐渐从10％减至0％；将生长良好的已适应无血清培养的MDCK细胞经0.25％EDTA-胰酶消化后，进行摇床培养，转速40r/min；待细胞生长速率稳定后传代，逐步扩大培养，并逐步提高摇床转速，直至驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系；将上述驯化完成的MDCK细胞系接种于5L生物反应器，接种密度为2×106cells/ml，培养条件为温度37℃，pH值7.2，溶氧40％，110r/min；扩增至1×107cells/ml时完成初级细胞培养；(2)病毒接种：将鸡胚繁殖的禽流感H5N1亚型病毒液接种至致密单层的贴壁MDCK细胞，以病毒维持液进行培养；传代5次；待细胞病变达90％时收集培养上清液，以3500r/min离心15min，沉淀弃去，取上清液作为悬浮MDCK细胞培养用种毒；取上述适量贴壁培养MDCK细胞增殖的H5N1亚型禽流感病毒，按照MOI为10-3-10-1接种于5.0×106cells/mL悬浮MDCK细胞，培养条件为34℃，pH7.3，溶氧40％，搅拌转速110r/min；(3)收集病毒液：接毒后培养48-72h，当细胞活力降至40-60％时分离上清液收获病毒液；收集病毒液后，还可连续多次添加新鲜培养基继续培养，重复多次收获病毒液；(4)病毒灭活：采用化学试剂如β丙内酯、烷化剂、苯酚、甲醛等灭活病毒，使病毒失去感染力，但保持病毒的抗原性和免疫原性。所述甲醛浓度为1/1500-1/6500，37℃下灭活16-48h，室温下灭活6-15天；多次收获的病毒液可合并后进行灭活，灭活前后采样进行无菌测定，灭活时还可加入防腐剂α-生育酚琥珀酸盐或汞化合物；(5)纯化病毒液：采用离心或澄清膜处理病毒液，去除杂质碎片，如4℃，8000-10000r/min，离心10min，所述澄清膜选择0.4μm膜；进一步采用柱层析法纯化病毒液，具体使用凝胶过滤层析法有效去除病毒液中残留的小分子杂质；(6)疫苗配制：添加佐剂将病毒液配制成疫苗形式，所述佐剂为矿物质类或双相乳剂。进一步的，所述步骤(1)中生物反应器为能够自动控制温度、PH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于悬浮培养的生物反应器。进一步的，所述步骤(2)中病毒维持液的组成为，各组分的浓度以mg/L计：丝氨酸250、精氨酸250、亮氨酸55、异亮氨酸250、丙氨酸2、酪氨酸55、天冬酰胺25、天冬氨酸25、盐酸半胱氨酸55、谷氨酸50、谷氨酰胺50、组氨酸250、赖氨酸250、苯丙氨酸55、苏氨酸55、色氨酸250、缬氨酸250；次黄嘌呤20、胸苷5、腺苷5、尿苷5、鸟苷5；硒0.1、铬0.1、钴0.05、镍0.05、锌0.1、铜0.1、锰0.1、钡0.1、镓0.05、锂0.1、锡0.1、碘0.1、钒0.1、锗0.05、钼0.05、硅0.1、铁0.1、铷0.05、锆0.05、镉0.1、铝0.1；生物素0.05、D-泛酸钙0.1、叶酸0.05、烟酰胺0.05、盐酸吡哆醇0.05、核黄素0.1、盐酸硫胺素0.05、维生素B120.1、维生素B20.1、肌醇0.1；氯化钠500、氯化钾500、硫酸铜55、硝酸铁55、硫酸亚铁55、氯化镁55、无水磷酸氢二钠250、磷酸二氢钠250、亚硒酸钠250、硫酸锌5本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：/n(1)细胞培养：复苏培养贴壁的MDCK细胞，待细胞生长至致密单层后，消化传代；逐步减少FBS比例直至0％；摇床扩大培养，直至驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系；接种于生物反应器，完成初级细胞培养；/n(2)病毒接种：将鸡胚繁殖的禽流感病毒液接种至致密单层的贴壁MDCK细胞，获得悬浮MDCK细胞培养用种毒；取上述禽流感病毒种毒接种于悬浮MDCK细胞，进行培养；/n(3)收集病毒液：分离收获病毒液；/n(4)病毒灭活：采用化学试剂灭活病毒；/n(5)纯化病毒液：采用离心或澄清膜处理病毒液，去除杂质碎片；/n(6)疫苗配制：添加佐剂将病毒液配制成疫苗形式。/n

【技术特征摘要】
1.一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)细胞培养：复苏培养贴壁的MDCK细胞，待细胞生长至致密单层后，消化传代；逐步减少FBS比例直至0％；摇床扩大培养，直至驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系；接种于生物反应器，完成初级细胞培养；
(2)病毒接种：将鸡胚繁殖的禽流感病毒液接种至致密单层的贴壁MDCK细胞，获得悬浮MDCK细胞培养用种毒；取上述禽流感病毒种毒接种于悬浮MDCK细胞，进行培养；
(3)收集病毒液：分离收获病毒液；
(4)病毒灭活：采用化学试剂灭活病毒；
(5)纯化病毒液：采用离心或澄清膜处理病毒液，去除杂质碎片；
(6)疫苗配制：添加佐剂将病毒液配制成疫苗形式。


2.根据权利要求1所述一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(5)还包括采用柱层析法纯化病毒液。


3.根据权利要求2所述一种采用MDCK细胞系生产禽流感疫苗的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
(1)细胞培养：将DMEM、F12和RPMI1640按照3∶1∶1的比例进行混合均匀，以此为基础培养基并添加10％FBS，复苏培养贴壁的MDCK细胞，待细胞生长至致密单层后，0.25％EDTA-胰酶消化，传代5次；逐步减少含10％FBS的DMEM-F12-RPMI1640培养基比例、增加无血清的DMEM-F12-RPMI1640培养基比例，使血清含量逐渐从10％减至0％；
将生长良好的已适应无血清培养的MDCK细胞经0.25％EDTA-胰酶消化后，进行摇床培养，转速40r/min；待细胞生长速率稳定后传代，逐步扩大培养，并逐步提高摇床转速，直至驯化为稳定增殖的无血清全悬浮培养型MDCK细胞系；
将上述驯化完成的MDCK细胞系接种于5L生物反应器，接种密度为2×106cells/ml，培养条件为温度37℃，pH值7.2，溶氧40％，110r/min；扩增至1×107cells/ml时完成初级细胞培养；
(2)病毒接种：将鸡胚繁殖的禽流感H5N1亚型病毒液接种至致密单层的贴壁MDCK细胞，以病毒维持液进行培养；传代5次；待细胞病变达90％时收集培养上清液，以3500r/min离心15min，沉淀弃去，取上清液作为悬浮MDCK细胞培养用种毒；
取上述适量贴壁培养MDCK细胞增殖的H5N1亚型禽流感病毒，按照MOI为10-3-10-1接种于5.0×106cells/mL悬浮MDCK细胞，培养条件为34℃，pH7.3，溶氧40％，搅拌转速110r/min；
(3)收集病毒液：接毒后培养48-72h，当细胞活力降至40-6...

【专利技术属性】
技术研发人员：施维松，张晓楠，詹烜子，卢少华，刘德城，郑彩丽，孔凤英，
申请(专利权)人：肇庆大华农生物药品有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44