2019-nCoV双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法技术

本发明专利技术涉及病毒检测技术领域，具体公开了一种新型冠状病毒2019‑nCoV双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法。其中使用了偶联抗原的微球复合体组合，偶联抗原包括新型冠状病毒2019‑nCoV的S蛋白和新型冠状病毒2019‑nCoV的N蛋白，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ NO:1所示，所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ NO:2所示。制备的微球复合体组合能够对S抗体和N抗体进行双靶点检测，充分反映新型冠状病毒(2019‑nCoV)两种主要抗原刺激机体产生特异性抗体的效果。

【技术实现步骤摘要】
2019-nCoV双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法
本专利技术涉及病毒检测
，具体涉及一种2019-nCoV双靶点抗体检测微球复合体组合、制备方法、试剂盒及试剂盒使用方法。
技术介绍
核酸序列分析证明COVID-19由新型冠状病毒(2019novelcoronavirus,2019-nCoV)引起。2019-nCoV为正链单链RNA病毒，基因组长约30kb，两端为非编码区,中间为非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区。非结构蛋白编码区主要包括开放读码框架(openreadingframe,ORF)1a和ORF1b基因，编码16个非结构蛋白(non-structuralproteins,NSP)，即NSP1～16。结构蛋白编码区主要编码刺突(spike,S)蛋白、包膜(envelope,E)蛋白、膜(membrane,M)蛋白和核衣壳(nucleocapsid,N)蛋白。深入了解2019-nCoV基因组的结构和蛋白功能，将为2019-nCoV相关的病毒溯源、复制增殖、致病免疫、药物与疫苗研发以及当前疫情的防控提供有力的支撑。其中，S蛋白和N蛋白相对保守，在病毒的结构蛋白中所占比例最大，感染早期机体就能产生抗S蛋白和N蛋白的高水平抗体。其中，S蛋白介导病毒识别宿主细胞受体，促进膜融合，并诱导免疫反应产生中和抗体。N蛋白含有N1和N2表位，表位N1能刺激机体产生高亲和例的抗体，但没有中和活性。
技术实现思路
在常规的抗体检测方法中，一般只使用一种抗原检测血液样本中的抗体，结果会导致一定程度的漏检。本专利技术提供一种分别偶联S蛋白和N蛋白的微球复合体组合，能够同时对S蛋白的抗体和N蛋白的抗体进行特异性结合，从而提高检出率，减少漏检发生。为实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种新型冠状病毒2019-nCoV双靶点抗体检测的微球复合体组合，包括S微球复合体和N微球复合体，所述S微球复合体为偶联有新型冠状病毒2019-nCoV的S蛋白的荧光微球，所述N微球复合体为偶联有新型冠状病毒2019-nCoV的N蛋白的荧光微球，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQNO:1所示，所述N蛋白的氨基酸序列如SEQNO:2所示。一种新型冠状病毒2019-nCoV双靶点I抗体检测的微球复合体组合的制备方法，包括以下步骤：S1：利用基因工程手段克隆得到2019-nCoV的S蛋白和2019-nCoV的N蛋白；S2：采用两步酰胺反应法分别将S蛋白和N蛋白与各自对应的荧光微球进行偶联。一种新型冠状病毒2019-nCoV双靶点抗体检测的试剂盒，包括所述的微球复合体组合、微球稀释液、PBST、生物素标记抗IgG抗体、链霉素-藻红蛋白、鞘液。一种新型冠状病毒2019-nCoV双靶点抗体检测的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：S30：用所述微球稀释溶液分别稀释所述S微球复合体和所述N微球复合体，得到S荧光微球悬浮液和N荧光微球悬浮液，室温孵育后，分别加入待检测样品稀释液，室温下振荡，避光孵育，用PBST溶液洗涤；S31：加入生物素标记抗IgG抗体溶液，室温震荡，避光孵育，用PBST溶液洗涤；S32：加入链霉素-藻红蛋白溶液，室温震荡，避光孵育，用PBST溶液洗涤；S33：加入鞘液，重悬微球，采用流式点阵仪进行读数分析，得到每个待检测样品的SIgG抗体的MESF值和NIgG抗体的MESF值。与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括：1、本专利技术制备的荧光微球能够对S抗体和N抗体进行双靶点检测，充分反映新型冠状病毒(2019-nCoV)两种主要抗原刺激机体产生特异性抗体的效果。2、应用制备的荧光微球进行流式荧光免疫检测，样本用量少，可以采用指尖采血，并且一次采血的样本量可以满足多次检测使用。灵敏度度高，检测样本血清稀释度超过1:50，结合MESF值能有效地检测出S抗体和N抗体。3、本专利技术建立的流式荧光法检测2019-nCoVS-IgG或2019-nCoVN-IgG抗体的特异性良好。双靶点微球检测同时S-IgG抗体N-IgG抗体不会相互影响，无交叉反应。4、本专利技术使用的双靶点抗体检测方法的批间变异系数更小，说明双靶点抗体检测更精确、更稳定，相对应单靶点抗体检测检出率更高。附图说明图1是本专利技术实施例提供的S基因扩增电泳图；图2是本专利技术实施例提供的S蛋白纯化电泳图；图3是本专利技术实施例提供的N基因扩增电泳图；图4是本专利技术实施例提供的N蛋白纯化电泳图；图5是本专利技术实施例提供的S蛋白的抗原性验证；图6是本专利技术实施例提供的N蛋白的抗原性验证；图7是本专利技术实施例提供的S-IgG和N-IgG检测方法特异性分析。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂盒材料。主要试剂2019-nCoV样本及其S基因质粒和N基因质粒均来源于国家病毒资源库；羧基化荧光编码微球、校正准试剂、鞘液、1.5mL磁力架均为湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司产品；乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、琥珀酰亚氨基磺酸基生物素(Sulfo-NHS-Biotin)、2-[N-吗啉代]乙磺酸(MES)、叠氮钠购自美国ThermoFisher公司；链霉素-藻红蛋白(SA-PE)购自Invitrogen公司；Microplates96孔板购自洁特公司。主要仪器流式点阵仪NovaHT为湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司产品；酶标仪为TEACON公司产品。S蛋白的制备S110：S基因克隆及扩增根据公开的如SEQNO:3所示的S基因核苷酸序列，设计其上下游引物SF(如SEQNO:5)和SR(如SEQNO:6)，具体如下：SF：5’-cgcggatcccgcgtgcagcccaccgagag-3’；SR：5’-cccaagctttcagaagttcacgcacttgttct-3’；应用上述SF/SR引物对S基因质粒进行PCR扩增，产物筛选、纯化、鉴定得到扩增后的S基因序列，扩增后条带如图1所示；S111：载体构建：将S基因序列连接入pET32a(+)的BamHI位点和HindIII位点之间，N端加入ATG标签，C端加6×his-tag标签和TAG标签，连接后转入大肠杆菌DH5a中扩增，提取后得到重组质粒pET32a(+)S；S112：将重组质粒pET32a(+)S转化至BL21(DE3)大肠杆菌中表达，具体步骤如下：S1220：将重组质粒转化BL21感受态菌体，得到BL21-pET32-SP菌株；...

【技术保护点】
1.一种新型冠状病毒2019-nCoV双靶点抗体检测的微球复合体组合，其特征在于，包括S微球复合体和N微球复合体，所述S微球复合体为偶联有新型冠状病毒2019-nCoV的S蛋白的荧光微球，所述N微球复合体为偶联有新型冠状病毒2019-nCoV的N蛋白的荧光微球，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQ NO:1所示，所述N蛋白的氨基酸序列如SEQ NO:2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种新型冠状病毒2019-nCoV双靶点抗体检测的微球复合体组合，其特征在于，包括S微球复合体和N微球复合体，所述S微球复合体为偶联有新型冠状病毒2019-nCoV的S蛋白的荧光微球，所述N微球复合体为偶联有新型冠状病毒2019-nCoV的N蛋白的荧光微球，所述S蛋白的氨基酸序列如SEQNO:1所示，所述N蛋白的氨基酸序列如SEQNO:2所示。


2.根据权利要求1所述的微球复合体组合，其特征在于，所述荧光微球为聚苯乙烯微球、乳胶微球或磁性微球。


3.一种新型冠状病毒2019-nCoV双靶点抗体检测的微球复合体组合的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：利用基因工程手段克隆得到2019-nCoV的S蛋白和2019-nCoV的N蛋白；
S2：采用两步酰胺反应法分别将S蛋白和N蛋白与各自对应的荧光微球进行偶联。


4.根据权利要求3所述的微球复合体组合的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中S蛋白的制备方法为：
S110：得到如核苷酸序列SEQNO:3所示的S基因；
S111：将S基因连接入pET32a(+)的BamHI位点和HindIII位点之间，N端加入ATG标签，C端加6×his-tag标签和TAG标签，连接后转入大肠杆菌DH5a中扩增，提取后得到重组质粒pET32a(+)S；
S112：将重组质粒pET32a(+)S转化至BL21(DE3)大肠杆菌中表达；
S113：收集菌体，调节pH8.0，超声破碎，离心取上清用镍柱纯化，即可得到所述S蛋白。


5.根据权利要求3所述的微球复合体组合的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中N蛋白的制备方法为：
S120：得到如核苷酸序列SEQNO:4所示的S基因；
S121：将N基因连接入pET32a(+)的BamHI位点和HindIII位点之间，HindIII位点前加TGA标签，连接后转入大肠杆菌DH5a中扩增，提取后得到重组质粒pET32a(+)N；
S122：将重组质粒pET32a(+)N转化大肠杆菌BL21感受态菌体中表达；
S123：收集菌体，破碎，调节pH8.0，离心取上清用镍柱纯化，即可得到所述N蛋白。

【专利技术属性】
技术研发人员：王华林，张涛，易辉，王万朝，
申请(专利权)人：湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42