一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术实施例提供了一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，包括SEQ ID No:1所示的多肽包被的ELISA检测板、血清稀释液、洗涤液、二抗、化学发光剂；采用所述试剂盒通过包被可溶性抗原多肽，直接检测猪血清中的猪流行性腹泻病毒N蛋白抗体，实现猪流行性腹泻病毒的快速准确检测。此外，采用本申请的试剂盒，以可溶性多肽包作为包被抗原，结合化学发光检测法，使采用所述试剂盒检测猪流行性腹泻病毒抗体具有更高的灵敏度和准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及ELISA检测
，特别是涉及一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒及其应用。
技术介绍
猪流行性腹泻病(Porcineepidemicdiarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的疾病，其症状与猪的传染性胃肠炎(TGE)相似，主要包括腹泻，呕吐，厌食，脱水，和仔猪体重减轻等。尽管各年龄段猪均可感染并出现不同程度的症状，但仔猪病情特别严重，其中死亡率高达100％。目前猪流行性腹泻在实验室的检测方法主要有：酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassayELISA)、环介导等温扩増技术(loop-mediatedisothermalamplificationLAMP)和聚合酶链式反应(PolymeraseChainReactionPCR)等，其中酶联免疫吸附技术相对成熟，准确性相对较高，并且反应时间短，其操作简单，仪器试剂成本较低。目前已经商品化的ELISA检测试剂盒用于检测猪流行性腹泻病毒需要大概3小时，且ELISA检测的数据阴阳性跨度小，有很大一部分可疑区间，检测准确性不够高，因此，需要发展一种新的ELISA检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于提供一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，以实现猪流行性腹泻病毒抗体的快速、准确检测。具体技术方案如下：本申请第一方面提供了一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，其包括SEQIDNo:1所示的多肽包被的ELISA检测板、血清稀释液、洗涤液、二抗、化学发光剂；其中，所述多肽为可溶性多肽；所述二抗为辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG。本申请第二方面提供了SEQIDNo:1所示的多肽在制备猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒中的应用，其中，所述多肽为可溶性多肽。本专利技术提供的猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，通过包被可溶性抗原多肽，直接检测猪血清中的猪流行性腹泻病毒N蛋白抗体，实现猪流行性腹泻病毒的快速准确检测。此外，采用本申请的试剂盒，以可溶性多肽包作为包被抗原，结合化学发光检测法，使采用所述试剂盒检测猪流行性腹泻病毒抗体具有更高的灵敏度和准确性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为pGEX-4T-1质粒载体的质粒图谱；图2为重组质粒转化感受态大肠杆菌后，蛋白表达的SDS-PAGE结果；图3为重组质粒转化感受态大肠杆菌后，蛋白表达的Westernbloting结果；图4A为猪血清样品的ROC曲线；图4B为图4A的背景交互点图。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本申请第一方面提供了一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，其包括SEQIDNo:1所示的多肽包被的ELISA检测板、血清稀释液、洗涤液、二抗、化学发光剂；其中，所述多肽为可溶性多肽；所述二抗为辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG。专利技术人在研究中发现，SEQIDNo:1所示的多肽中存在多个构象表位，能够与猪血清中的猪流行性腹泻病毒抗体发生特异性结合，并基于此，实现对猪流行性腹泻病毒抗体的检测。本申请的试剂盒中，所述多肽为可溶性多肽，与包涵体形式的多肽相比，其与抗体的结合效率更高，特异性更强，因此采用所述可溶性多肽的试剂盒，对猪流行性腹泻病毒抗体具有更高的特异性和灵敏度。进一步地，本申请的试剂盒中采用化学发光显色，灵敏度高、反应时间短、操作简单，其与本申请的间接法ELISA相结合，使检测具有更高地灵敏度和准确性。所述可溶性多肽的氨基酸序列如下：MASVSFQDRGRKRVPLSLYAPLRVTNDKPLSKVLANNAVPTNKGNKDQQIGYWNEQIRWRMRRGERIEQPSNWHFYYLGTGPHGDLRYRTRTEGVFWVAKEGAKTEPTNLGVRKASEKPIIPKFSQQLPSVVEIVEPNTPPASRANSRSR(SEQIDNo:1)本申请对ELISA检测板的选择不做限定，只要能够实现本专利技术的目的即可，例如可以选自本领域常用的酶标板，或可拆卸酶标板。本申请中SEQIDNo:1所示的多肽包被的ELISA检测板可采用常规的ELISA检测板的制备方法制备，本申请在此不做限定，在本申请的一些实施方式中，可通过以下方法制备：(1)以含有1.0-4.0μg/ml所述多肽的碳酸盐缓冲溶液为包被液，2-8℃包被所述ELISA检测板1-12小时；(2)PBST清洗3-5次；(3)以40-60mg/100mL的脱脂奶粉PBST溶液为封闭液，35-38℃下封闭清洗后的ELISA检测板0.5-2小时；(4)PBST清洗3-5次，干燥。本申请中的碳酸盐缓冲溶液为本领域常用碳酸盐缓冲液(CBS)，其配方为本领域公知常识，本申请在此不做限定，示例性的，本申请的CBS可采用Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，溶于蒸馏水中，定容至1L，pH9.6，4℃保存。本申请中所采用的洗涤液可以为ELISA检测中常用的洗涤液，本申请在此不做限定，示例性的，可以为PBST溶液，专利技术人在研究中发现，当采用含有体积分数为0.05-0.2％Tween-20的磷酸缓冲液(PBS)作为洗涤液时，检测结果具有更好的特异性，不限于任何理论，这可能是由于，当PBST中的Tween-20的体积分数为0.05-0.2％时，能够有效地去除非特异性吸附的蛋白质，从而使检测结果的准确性、特异性更高。本申请中所采用的血清稀释液为本领域常用的血清稀释液，本申请在此不做限定，示例性地，可以采用40-60mg/mL的脱脂奶粉的PBST溶液，其中脱脂奶粉采用市售的脱脂奶粉即可。以上所述PBS的配方为本领域常规配方，示例性地，本领域通常配备的5×PBS溶液配方如表1所示：表1使用时，以水稀释5倍使用。本申请中所述的辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG可以选自来自不同物种的抗猪IgG，例如兔抗猪IgG，鼠抗猪IgG等，只要能够实现本专利技术的目的即可，本申请在此不做限定。辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG可通过商业途径获得。本申请中所采用的化学发光剂为本领域常用的辣根过氧化物酶的发光底物，本领域技术人员可根据需要具体选择，本申请在此不做限定。在本申请的一些实施方式中，所述化学发光剂可选自鲁米诺或其衍生物、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，其包括SEQ ID No:1所示的多肽包被的ELISA检测板、血清稀释液、洗涤液、二抗、化学发光剂；/n其中，所述多肽为可溶性多肽；所述二抗为辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG。/n

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒，其包括SEQIDNo:1所示的多肽包被的ELISA检测板、血清稀释液、洗涤液、二抗、化学发光剂；
其中，所述多肽为可溶性多肽；所述二抗为辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述化学发光剂选自鲁米诺或其衍生物、双(2,4,6-三氯苯基)草酸酯、光泽精或KMnO4中的至少一种。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，还包括发光增强剂，所述发光增强剂选自对碘苯酚、对苯基苯酚或肉桂酸中的至少一种。


4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，所述多肽通过以下方法制备：
(1)以SEQIDNo:2所示的DNA片段为模板，以SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示的DNA片段作为引物，进行PCR扩增，获得上下游分别引入BamHⅠ和XhoI酶切位点的DNA片段；
(2)将PCR扩增得到的DNA片段与pGEX-4T-1载体重组获得重组质粒；
(3)以所述重组质粒转化感受态大肠杆菌后，扩增培养，待OD600值达到0.6-0.8之间，加入终浓度为0.3-0.5mmol/L异丙基-...

【专利技术属性】
技术研发人员：马晓霞，马忠仁，郭富城，
申请(专利权)人：西北民族大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62