本发明专利技术涉及免疫诊断技术领域，针对现有技术的抗原检测布鲁氏菌抗体会导致检测结果不准确的问题，公开了一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，所述快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，具体包括以下步骤：1）制备检测线T和质控线C；2）金标垫的制备；3）制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、微球探针处理垫、包被好抗体的改性硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装，即得成品。本发明专利技术制备得到能准确检测出是否患有布鲁氏菌病，且本产品是采用抗体检测抗原的方式，抗原没有潜伏期，较检测抗体的产品更准确，检测抗原的准确性较检测抗体高，检测效率高，制备工艺简单。
【技术实现步骤摘要】
一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸
本专利技术涉及免疫诊断
，尤其涉及一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸。
技术介绍
布鲁氏菌病简称布病，是有布鲁氏菌一起的一种人畜共患的传染变态反应性疾病。布病具有高度传染性，已被CDC列为B类病原体，因此被认为是潜在的生物武器。此病在世界170多个国家和地区存在。人畜间布病流行，约占世界1/5～1/6的人受布病的威胁，全世界布病患者约有500-600万人，每年造成的经济损失高达数十亿美元。而且此病还对人类健康造成严重威胁。人类布鲁氏菌的感染一方面是由于接触患病动物，另一方面是由于接触或食用各种被病菌污染的动物产品及其食品。布病的感染率与所从事的职业密切相关，兽医、牧民、屠宰工、皮毛工和肉类食品加工者是布病的高危人群。饮食习惯很重要，未经高温灭菌的牛奶、酸奶，食用生肉或未熟的肉都会增加感染的几率。布病还可以通过呼吸道途径高度接触性传染。目前，针对布病的诊断方法主要有虎红平板凝集实验，补体结合实验(CFT)检测，酶联免疫(ELISA),生物分子学诊断等这些方法都是适用于实验室研究，检测时间较长，不适合基层检测，因此，迫切需要研发一种更简便、更快速的检测方法。专利号CN201510477774.8，专利名称“牛布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条”，本专利技术本专利技术涉及一种快速、高效、准确的牛布鲁氏菌胶体金诊断方法。该胶体金使用布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)作为测试线包被抗原，提高了检测的敏感性；改进了LPS纯化和纯度测定方法，使开发的试剂盒具有良好的特异性；本专利技术利用鼠抗牛IgG-Fc端的单克隆抗体标记胶体金制成胶体金抗体检测试纸条的金胶垫，进一步提高了检测的特异性。其不足之处在于，上述检测方法采用抗原检测布鲁氏菌抗体，而抗体的出现有个窗口期，所以病菌的潜伏周期较长，检测结果不够准确。
技术实现思路
本专利技术是为了克服现有技术的抗原检测布鲁氏菌抗体会导致检测结果不准确的问题，提供一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，制备得到能准确检测出是否患有布鲁氏菌病，且本产品是采用抗体检测抗原的方式，抗原没有潜伏期，较检测抗体的产品更准确，检测抗原的准确性较检测抗体高，检测效率高，制备工艺简单。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，包括PVC底板，所述PVC底板依次设有样品垫、金标探针处理垫、改性硝酸纤维素膜和吸水垫，PVC底板中间设有改性硝酸纤维素膜，所述改性硝酸纤维素膜两端分别设有微球探针处理垫和吸水垫，所述金标探针处理垫和所述吸水垫一端底侧分别连接于所述改性硝酸纤维素膜的两端，另一端底侧分别与PVC底板连接；金标探针处理垫与PVC底板连接的一端上侧设有样品垫，所述样品垫一端底侧与微球探针处理垫上侧连接，另一端底侧与PVC底板连接，所述改性硝酸纤维素膜的非连接段从微球探针处理垫一侧开始依次设有包被鼠抗布鲁氏菌抗体的检测线T和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C。产品所运用的原理为胶体金免疫层析、双抗夹心法，当样本中含有布鲁氏菌抗原，加样后该抗原会先与标记垫中的鼠抗布鲁氏菌单克隆抗体-金标探针结合，形成抗原-抗体复合物，随着层析过程的进行，该复合物会被包被在硝酸纤维素膜上的鼠抗布鲁氏菌单克隆抗体捕获，形成鼠抗布鲁氏菌单克隆抗体-布鲁氏菌抗原-鼠抗布鲁氏菌抗体-金标探针，颜色呈紫红色，清晰可辨，且不需要任何辅助设备，操作方便。感染布鲁氏菌后，一般患者7-15天才会出现抗体，因此检测抗原比检测抗体能更早的排除布病的感染。利用上述的试纸条，可以检测含有布鲁氏菌抗原的样本。将样本用试纸条进行检测，当检测线T和质控线C均出现红色条带，说明样本感染了布鲁氏菌；若仅有质控线C出现红色条带，说明样本未感染布鲁氏菌；若质控线C没有出现红色条带，则说明该试纸条失效。作为优选，所述金标探针处理垫为标记布鼠抗鲁氏菌抗体-胶体金偶联物的金标垫。胶体金探针，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的静电结合，并且不影响蛋白质的生物特性。胶体金探针因包括相应的抗体和显色颗粒，因此在整个过程中起到结合和显色的作用，较好的金标探针应粒径大小合适、均匀度好、色彩透明度高。作为优选，所述检测线T包被的包被用鼠抗布鲁氏菌抗体浓度为0.1～1.0mg/ml。当包被抗体浓度低于0.1mg/ml，反应过程中，样本中布鲁氏菌抗原被鼠抗布鲁氏菌单克隆抗体捕获不充分，临床上出现漏检情况。当包被抗体浓度高于1mg/ml，样本中的杂蛋白在层析过程中会被非特异性捕获，临床上会出现假阳性风险，因此检测线T包被用鼠抗布鲁斯菌抗体的最佳浓度范围为0.1mg/ml-1mg/ml。作为优选，所述质控线C包被的羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0～3.0mg/ml。当质控线包被抗体浓度低于1mg/ml，反应过程中，标记垫中的鼠IgG单克隆抗体-金标偶联物和羊抗鼠多克隆抗体结合不充分，临床上出现质控线偏弱的问题。当质控线包被抗体浓度高于3mg/ml，处理到硝酸纤维素膜上的羊抗鼠多克隆抗体因溢量会出现扩散现象，影响整体美观。因此质控线C包被用羊抗鼠IgG多克隆抗体的最佳浓度范围为1mg/ml-3mg/ml。作为优选，所述胶体金颗粒直径为40-100nm，此处标记后鼠抗布鲁氏菌单克隆抗体-胶体金偶联物的使用浓度应为OD1-OD4。氯金酸通过还原剂柠檬酸三钠反应成一定粒径大小的金颗粒，颗粒大小的不同会影响产品的性能、标记偶联物的稳定性以及标记偶联物的颜色，颗粒大小＜40nm颜色偏红，灵敏度较弱；而颗粒大小＞100nm颜色偏黑，形状不均匀，及其容易沉淀，因此胶体金颗粒粒径为40-100nm最为合适。将鼠抗布鲁氏菌单克隆抗体用70nm金颗粒标记成鼠抗布鲁氏菌-胶体金偶联物，并按吸光度为OD0.5、OD1.0、OD2.0、OD3.0、OD4.0、及OD5.0处理到玻璃纤维上，置于真空冷冻干燥设备过夜(12-24小时)。用布鲁氏菌阳性参考品1：2000，1:10000，1:20000和阴性参考品进行测试，10-20分钟读数结果显示鼠抗布鲁氏菌单克隆抗体-金标偶联物的使用浓度OD1-OD4时，效果最佳。所述快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，具体包括以下步骤：1)制备检测线T和质控线C：分别将鼠抗布鲁氏菌抗体和羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后分别以1.0-1.2ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上分别作为检测线T和质控线C，置于36-38℃烘干，得到检测线和质控线；2)金标垫的制备：将纯化的金标抗体稀释后浓度为OD1-OD4时包被于玻纤垫上置于冷冻干燥机处理，制得金标垫；3)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、微球探针处理垫、包被好抗体的改性硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装，即得成品。制备过程中关键工艺技术为步骤2)中的冷冻干燥处理，冷冻干燥处理在真空条件下进行，相较于常规的鼓风干燥本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，包括PVC底板（7），所述PVC底板（7）依次设有样品垫（1）、微球探针处理垫（2）、改性硝酸纤维素膜（5）和吸水垫（6），PVC底板（7）中间设有改性硝酸纤维素膜（5），所述改性硝酸纤维素膜（5）两端分别设有微球探针处理垫（2）和吸水垫（6），所述微球探针处理垫（2）和所述吸水垫（6）一端底侧分别连接于所述改性硝酸纤维素膜（5）的两端，另一端底侧分别与PVC底板（7）连接；微球探针处理垫（2）与PVC底板（7）连接的一端上侧设有样品垫（1），所述样品垫（1）一端底侧与微球探针处理垫（2）上侧连接，另一端底侧与PVC底板（7）连接，所述改性硝酸纤维素膜（5）的非连接段从微球探针处理垫（2）一侧开始依次设有包被鼠抗布鲁氏菌抗体的检测线T（3）和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C（4）。/n
【技术特征摘要】
1.一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，包括PVC底板（7），所述PVC底板（7）依次设有样品垫（1）、微球探针处理垫（2）、改性硝酸纤维素膜（5）和吸水垫（6），PVC底板（7）中间设有改性硝酸纤维素膜（5），所述改性硝酸纤维素膜（5）两端分别设有微球探针处理垫（2）和吸水垫（6），所述微球探针处理垫（2）和所述吸水垫（6）一端底侧分别连接于所述改性硝酸纤维素膜（5）的两端，另一端底侧分别与PVC底板（7）连接；微球探针处理垫（2）与PVC底板（7）连接的一端上侧设有样品垫（1），所述样品垫（1）一端底侧与微球探针处理垫（2）上侧连接，另一端底侧与PVC底板（7）连接，所述改性硝酸纤维素膜（5）的非连接段从微球探针处理垫（2）一侧开始依次设有包被鼠抗布鲁氏菌抗体的检测线T（3）和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C（4）。
2.根据权利要求1所述一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，所述微球探针处理垫（2）为标记布鼠抗鲁氏菌抗体-胶体金偶联物的金标垫。
3.根据权利要求1所述一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，所述检测线T（3）包被的包被用鼠抗布鲁氏菌抗体浓度为0.1~1.0mg/ml。
4.根据权利要求1所述一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，所述质控线C（4）包被的羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0~3.0mg/ml。
5.根据权利要求2所述一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，所述胶体金颗粒直径为40-100nm，此处标记后鼠抗布鲁氏菌单克隆抗体-胶体金偶联物的使用浓度应为OD1-OD4。
6.如权利要求1-5任一所述快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤：
1）制备检测线T和质控...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈金树，张芳，陆维克，高飞，
申请(专利权)人：杭州奥泰生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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