【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体涉及r-藻红蛋白与链酶亲和素的交联方法。
技术介绍
1、链霉亲和素(sa)是与亲和素(av)有相似生物学特性的一种蛋白质，是亲和素链霉菌(streptomycesavidinii)的分泌物，其分子量及结合生物素的能力与鸡蛋清中的亲和素相似，等电点6.0，非特异性结合远比亲和素低。链霉亲和素是四聚体蛋白，大小为66kda。一分子链霉亲和素可以高度特异性地与四分子生物素结合，两者之间的亲和力极为强烈，链霉亲和素-生物素复合物的解离常数处于10-14mol/l数量级，这一性质常用于分子生物学用途。其中一条完整的sa肽链中有159个氨基酸残基，分子量为16450da。
2、藻红蛋白(p-phycoerythrin,pe)是从红藻中分离纯化的，普遍使用地新型荧光标记试剂。在特定波长激发下，藻红蛋白能发射强烈的荧光，其荧光强度是荧光素的30-100倍，具有很好的吸光性能和很高的量子产率，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围。
3、链霉亲和素与r-藻红蛋白(r-pe)的交联物由一种共价结合荧光标记物(r-pe)的生物素结合蛋白(链霉亲和素)组成。链霉亲和素与生物素结合的亲和力非常高，带链霉亲和素的交联物通常和带生物素的交联物一起使用，专门用于检测各种蛋白、蛋白模体、核酸或其他分子。在开发流式细胞分析、微孔板检测和芯片应用的生物素-链霉亲和素检测方案时，链霉亲和素r-pe具有超高的利用价值。现有pe交联技术常常存在如下问题：
4、(1)所采用的巯基化试剂或活化试剂的种类或者使用量不易把控
5、(2)交联的链霉亲和素藻红蛋白在多重检测上经常会有背景值异常升高，阳性样本测试数值偏低，信噪比低的问题，对多重检测的部分结果存在干扰。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的目的在于提供一种r-藻红蛋白与链霉亲和素的新的交联方法，巯基化步骤只需一步，且交联物无需纯化即可保证在多重检测中对样本的基本没有干扰，降低了纯化成本，保持了蛋白良好的生物活性且缩短了制备时间。
2、本专利技术通过以下技术方案来实现上述目的：本专利技术提供一种r-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，包括以下步骤：
3、s1，采用6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯活化链霉亲和素，其中链霉亲和素与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的膜的摩尔比为1:(45～55)；
4、s2，采用2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐巯基化r-藻红蛋白，其中r-藻红蛋白与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐的摩尔比为1：(8～12)；
5、s3，将活化的链霉亲和素与巯基化的r-藻红蛋白交联，其中巯基化r-藻红蛋白和活化链霉亲和素的摩尔比为(2～4):1。
6、其工艺及原理如下：
7、
8、作为一种优选的实施方式，步骤s1中，链霉亲和素与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的膜的摩尔比为1:50；步骤s2中，r-藻红蛋白与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐的摩尔比为1：10；步骤s3中，巯基化r-藻红蛋白和活化链霉亲和素的摩尔比为3:1。
9、作为一种优选的实施方式，步骤s1中，6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯活化链霉亲和素的方法为：将脱盐处理后的链霉亲和素用ph 8.0±0.5的mops缓冲液稀释为1～3mg/ml；将6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯溶解于dmos溶液中配制8～12mg/ml的母液；将上述两种溶液混合后，室温旋转反应，超滤除去未结合的6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯，即得。
10、作为一种优选的实施方式，步骤s2中，2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐巯基化r-藻红蛋白的方法为：将r-藻红蛋白加入(15～25)mm、ph为7.2±0.5的hepes缓冲液重悬后，进行超滤除盐，调整浓度为3～7mg/ml；将2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶解于(15～25)mm、ph为7.2±0.5的hepes缓冲溶液中配制8～12mg/ml的母液；将上述两种溶液混合后，室温避光旋转反应，超滤除去未结合的2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐，即得。
11、作为一种优选的实施方式，步骤s3中，巯基化r-藻红蛋白和活化链霉亲和素混合后，避光旋转孵育结束后，加入半胱氨酸进行封闭，即得。
12、作为一种优选的实施方式，链霉亲和素通过以下方法制备得到：将优化后的链霉亲和素基因序列在大肠杆菌中进行表达，之后收集菌体、缓冲液清洗后，重悬于磷酸盐缓冲液中，经高压细胞破碎处理后，离心收集上清溶液，采用ni琼脂糖层析柱进行纯化表达的链霉亲和素，即得。
13、作为一种优选的实施方式，ni琼脂糖层析柱纯化时，平衡缓冲液为ph8.0±0.5的8～12mm pbs缓冲液，除杂缓冲液为ph 8.0±0.5的含有25～35mm咪唑、8～12mm pbs的缓冲液，洗脱缓冲液为ph 8.0±0.5的含有250～350mm咪唑、8～12mm pbs的缓冲液。
14、本专利技术提供的r-藻红蛋白(r-pe)与链霉亲和素交联方法，采用6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯(emcs)活化链霉亲和素，采用2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(2-it)巯基化r-藻红蛋白，最后再将两者交联，同时对其用量进行严格的控制，避免在制备过程中对蛋白被破坏，且巯基化步骤只需一步即可，保持了蛋白质的良好生物活性，制备得到的交联物无需纯化即可达到对样本的多重检测基本没有干扰的目的，具有具有更高的信号保留率，背景值更低，信噪比更高。
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1.一种R-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的R-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，步骤S1中，链霉亲和素与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的膜的摩尔比为1:50，步骤S2中，R-藻红蛋白与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐的摩尔比为1：10，步骤S3中，巯基化R-藻红蛋白和活化链霉亲和素的摩尔比为3:1。
3.根据权利要求1～2任一项所述的R-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，步骤S1中，6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯活化链霉亲和素的方法为：将脱盐处理后的链霉亲和素用pH 8.0±0.5的MOPS缓冲液稀释为1～3mg/mL；
4.根据权利要求1～2任一项所述的R-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，步骤S2中，2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐巯基化R-藻红蛋白的方法为：将R-藻红蛋白加入(15～25)mM、pH为7.2±0.5的HEPES缓冲液重悬后，进行超滤除盐，调整浓度为3～7mg/mL；
5.根据权利要求1～2任一项所述的R-藻红蛋白与链霉亲和素的交
6.根据权利要求1所述的R-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，链霉亲和素通过以下方法制备得到：将优化后的链霉亲和素基因序列在大肠杆菌中进行表达，之后收集菌体、缓冲液清洗后，重悬于磷酸盐缓冲液中，经高压细胞破碎处理后，离心收集上清溶液，采用Ni琼脂糖层析柱进行纯化表达的链霉亲和素，即得。
7.根据权利要求6所述的R-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，Ni琼脂糖层析柱纯化时，平衡缓冲液为pH 8.0±0.5的8～12mM PBS缓冲液，除杂缓冲液为pH 8.0±0.5的含有25～35mM咪唑、8～12mM PBS的缓冲液，洗脱缓冲液为pH 8.0±0.5的含有250～350mM咪唑、8～12mM PBS的缓冲液。
...【技术特征摘要】
1.一种r-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的r-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，步骤s1中，链霉亲和素与6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯的膜的摩尔比为1:50，步骤s2中，r-藻红蛋白与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐的摩尔比为1：10，步骤s3中，巯基化r-藻红蛋白和活化链霉亲和素的摩尔比为3:1。
3.根据权利要求1～2任一项所述的r-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，步骤s1中，6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯活化链霉亲和素的方法为：将脱盐处理后的链霉亲和素用ph 8.0±0.5的mops缓冲液稀释为1～3mg/ml；
4.根据权利要求1～2任一项所述的r-藻红蛋白与链霉亲和素的交联方法，其特征在于，步骤s2中，2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐巯基化r-藻红蛋白的方法为：将r-藻红蛋白加入(15～25)mm、ph为7.2±0.5的hepes缓冲液重悬后，进行超滤除盐，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王万朝，王华林，彭方鑫，
申请(专利权)人：湖北新纵科病毒疾病工程技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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