一种荧光探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种荧光探针及其制备方法和应用，所述荧光探针具有式I所示结构，该荧光探针保留了赖氨酸主链上的伯氨基，有利于该分子后期与纳米颗粒等的结合，可以实现对末端为羧基的分子或纳米材料的荧光标记，可用于肿瘤细胞的荧光成像，为肿瘤细胞的检测和治疗提供有利帮助，并且其对细胞无毒性，安全性高。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光探针及其制备方法和应用
本专利技术属于化学成像材料领域，涉及一种荧光探针及其制备方法和应用。
技术介绍
荧光成像是非常重要的成像方式，由于其简单、快速和灵敏度高的优点被广泛应用于生物医药领域。NBD(4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)是一种用途广泛的荧光分子，经常被用来标记蛋白、纳米颗粒等末端拥有氨基官能团的材料，却不能用于标记末端为羧基的分子或纳米材料。因此，在本领域中期望能够开发出更多NBD类的荧光探针以满足生物医药领域的需求。CN109734709A公开了一种小分子荧光探针，其具有如下结构：该荧光探针结合金属离子后能发射很强的荧光，可实现检测镓离子和铬离子，但该荧光探针并不适用于细胞成像领域。CN104478823A公开了一种赖氨酸修饰的苯并呋咱化合物，其具有如下结构：该化合物可以特异性检测铜离子，能够作为人体中由于铜离子在细胞中失衡导致抑制神经性的疾病以及内分泌紊乱的检测探针，对于医药领域具有重要意义，但是该探针是特异性检测铜离子的，并不能单独用于细胞的荧光成像。因此，在本领域期望能够开发能用于标记末端为羧基的分子或纳米材料的NBD类的荧光探针，用于细胞的荧光检测。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种荧光探针及其制备方法和应用。本专利技术的荧光探针将荧光分子NBD与1-苯基-3-[(4-氨甲基)氮杂环己烷]-2-丙醇(哌莫苯)通过赖氨酸进行偶联，构建新型荧光成像探针。本探针保留了赖氨酸主链上的伯氨基，有利于该分子后期与纳米颗粒等的结合，能够实现在细胞中的荧光成像。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一方面，本专利技术提供一种荧光探针，所述荧光探针具有如下式I所示结构：该荧光探针的化学命名为：1-(1-苯基-3-[(4-氨甲基)氮杂环己烷]-2-丙醇)-6-(4-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑)-赖氨酸(1-(1-phenyl-3-[(4-aminomethyl)azacyclohexane]-2-propanol-6-(4-nitro-2,1,3-benzoxadiazole)-lysin，简称BLN)，是一种橘红色粉末，分子简式为：C27H37N7O5，分子量：539.29。在本专利技术中该荧光探针保留了赖氨酸主链上的伯氨基，有利于该分子后期与纳米颗粒等的结合，可以实现对末端为羧基的分子或纳米材料的荧光标记，可用于细胞的荧光成像，例如可用于肿瘤细胞荧光成像，为肿瘤细胞的检测和治疗提供有利帮助，并且其对正常细胞无毒性，安全性高。另一方面，本专利技术提供了如上所述的荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将fmoc基团保护的赖氨酸(fmoc-lys)溶解在第一混合溶剂中，使其与4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑(NBD)接触，得到式Ⅱ所示化合物(fmoc-lys-NBD)；(2)在第二溶剂中，使碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和式Ⅱ所示化合物以及哌莫苯接触，得到式Ⅲ所示的化合物fmoc-(pimobenzene)-lys-NBD(fmoc-BLN)；(3)在第三有机溶剂中，使式Ⅲ所示的化合物发生fmoc脱保护反应，得到式Ⅰ所示的荧光探针(BLN)。在本专利技术中所使用的术语“接触”应做广义理解，其可以是任何能够使得至少两种反应物发生化学反应的方式，例如可以是将两种反应物在适当的条件下进行混合。根据需要，可以在搅拌下，将需要进行接触的反应物进行混合，由此，搅拌的类型并不受特别限制，例如可以为机械搅拌，即在机械力的作用下进行搅拌。优选地，步骤(1)所述fmoc基团保护的赖氨酸与4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为1:0.5-10，例如1:0.5、1:0.8、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10等，优选1:1。优选地，步骤(1)所述第一混合溶剂为甲醇和水的混合物或者DMF和有三乙胺的混合物，优选甲醇和水的混合物，所述甲醇和水的体积比为6:5。优选地，步骤(1)所述接触的温度为10-35℃，例如10℃、15℃、18℃、20℃、23℃、25℃、30℃或35℃等。优选地，步骤(1)所述接触的时间为6-24小时，例如6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时、20小时或22小时，优选12小时。以TLC(薄层板)监测反应物消失情况来确定反应终点。优选地，步骤(1)还包括将fmoc基团保护的赖氨酸(fmoc-lys)加入第一混合溶剂后，用碳酸钠调节反应液pH值至9-10，例如9、9.3、9.5、9.8或10等。优选地，步骤(1)还包括所述接触后，将最终反应液pH调为酸性，收集析出沉淀，并用饱和食盐水将pH值洗回中性，将粗产物真空干燥后，溶于甲醇与水的混合溶剂，并使用高效液相分离纯化。优选地，所述将最终反应液pH调为酸性时所用的pH调节剂为盐酸，优选为1M的盐酸。在本专利技术中，所述使用高效液相分离纯化时，使用乙腈和水为洗脱液，以20：80(V/V)为初始梯度，100：0(V/V)为终止梯度进行梯度淋洗。所述梯度淋洗时间优选为20-40min，例如20min、23min、25min、28min、30min、33min、35min、38min或40min。优选地，步骤(2)所述第二溶剂为二甲基亚砜和甲醇的混合物、二氯甲烷和甲醇的混合物、N,N'-二甲基甲酰胺(DMF)与甲醇的混合物或N,N'-二甲基甲酰胺，优选N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的混合物，所述N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的体积比优选为10：0-5，例如10:0、10:1、10:2、10:3、10:4、10:5等，当为10:0时即所述第二溶剂为单独的N,N'-二甲基甲酰胺。优选地，所述碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N'-二环己基碳二亚胺。优选地，所述酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑。优选地，式Ⅱ所示化合物与哌莫苯的摩尔比为1:1-2，例如1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9或1:2。优选地，所述哌莫苯与酰化活化剂的摩尔比为1:1-5，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。优选地，所述哌莫苯与碳二亚胺缩合剂的摩尔比为1:1-5，例如1:1、1:1.5、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。优选地，步骤(2)所述接触的温度为20-40℃，例如20℃、23℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃、38℃或40℃。优选地，步骤(2)所述接触的时间为8-24小时，例如8小时、9小时、10小时、12小时、14小时、15小时、17小时、19小时、20小时、22小时或24小时。在本专利技术中，步骤(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有如下式I所示结构：/n

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针，其特征在于，所述荧光探针具有如下式I所示结构：





2.根据权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将fmoc基团保护的赖氨酸溶解在第一混合溶剂中，使其与4-氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑接触，得到式Ⅱ所示化合物；



(2)在第二溶剂中，使碳二亚胺缩合剂、酰化活化剂和式Ⅱ所示化合物以及哌莫苯接触，得到式Ⅲ所示的化合物；



(3)在第三有机溶剂中，使式Ⅲ所示的化合物发生fmoc脱保护反应，得到式Ⅰ所示的荧光探针。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述fmoc基团保护的赖氨酸与4-氯-7硝基苯并-2-氧杂-1,3-二唑的摩尔比为1:0.5-10，优选1:1；
优选地，步骤(1)所述第一混合溶剂为甲醇和水的混合物或者DMF和三乙胺的混合物，优选甲醇和水的混合物，所述甲醇和水的体积比为6:5；
优选地，步骤(1)所述接触的温度为10-35℃；
优选地，步骤(1)所述接触的时间为6-24小时，优选12小时。


4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)还包括将fmoc基团保护的赖氨酸加入第一混合溶剂后，用碳酸钠调节反应液pH值至9-10；
优选地，步骤(1)还包括所述接触后，将最终反应液pH调为酸性，收集析出沉淀，并用饱和食盐水将pH值洗回中性，将粗产物真空干燥后，溶于甲醇与水的混合溶剂，并使用高效液相分离纯化；
优选地，所述将最终反应液pH调为酸性时所用的pH调节剂为盐酸，优选为1M的盐酸；
优选地，所述使用高效液相分离纯化时，使用乙腈和水为洗脱液，以20：80体积比为初始梯度，100:0体积比为终止梯度进行梯度淋洗；
优选地，所述梯度淋洗时间优选为20-40min。


5.根据权利要求2-4中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述第二溶剂为二甲基亚砜和甲醇的混合物、二氯甲烷和甲醇的混合物、N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的混合物或N,N'-二甲基甲酰胺，优选N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的混合物，所述N,N'-二甲基甲酰胺与甲醇的体积比优选为10：0-5；
优选地，所述碳二亚胺缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和/或N,N'-二环己基碳二亚胺；
优选地，所述酰化活化剂为N-羟基琥珀酰亚胺和/或1-羟基苯并三唑；
优选地，式(Ⅱ)所示化合物与哌莫苯的摩尔比为1:1...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈春英，周会鸽，李佳阳，郭梦雨，
申请(专利权)人：国家纳米科学中心，
类型：发明
国别省市：北京;11