本发明专利技术公开了一种高通量检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法。该方法，包括如下步骤：１）使发酵液中的丙酮与可溶性次碘酸盐反应，得到碘仿；２）检测所述碘仿的量，根据所述碘仿的量得到所述丙酮的量；３）根据所述丙酮的量，得到所述溶剂的量；所述溶剂为丙酮和如下有机溶剂中的至少一种：乙醇和丁醇。实验证明，本发明专利技术的检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法，检测结果可靠准确，与高效液相色谱法检测结果相当，但操作上比其简单、检测速度快，而且成本低廉，因此，本发明专利技术方法可以实现高通量快速检测，在菌的溶剂产量检测中将会有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高通量检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法。
技术介绍
目前，石油等化石燃料短缺、天然气和其他原料价格上扬、以及对温室气体减 排的要求，已迫使人们将注意力转向可再生能源，关注生物燃料的发展前景。丁醇 就是受关注的生物燃料之一。丁醇是一种重要的化工原料，主要用于制造增塑剂、 溶剂、萃取剂等；丁醇又是一种极具潜力的新型生物燃料，其热值、辛垸值与汽油 相当，含氧量与汽油中常用的甲基叔丁基醚相近，不会腐蚀管道，便于管道输送； 蒸汽压低，安全性高，且能与汽油以任意比混合。因其有诸多优点，因此被广泛关 注及应用，当今市场上丁醇已经供不应求。丁醇可由化学合成法和发酵法生产。化学合成法的主要路线包括两条， 一是以 丙烯为原料，经羰基合成法生成正、异丁醛，加氢后分馏得到正丁醇；二是以乙醛 为原料，经醇醛縮合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得到正丁醇。发酵法 则是以粮食为原料，经发酵获得溶剂(包括丙酮、丁醇、乙醇，质量比约为3: 6: 1)，再经精馏后分别制得丙酮、丁醇和乙醇。发酵法生产溶剂曾经是仅次于乙醇发 酵的全球第二大发酵工业。丁醇发酵中，溶剂毒性是影响溶剂产量的一个关键限制因素。在所产生的溶剂 中，丁醇是毒性最大的，当其浓度达到13g/L，发酵就基本停止。研究发现，丁醇 毒性的机制与其疏水性有关，它会破坏细胞膜的磷脂成份，使膜的流动性提高，可 能会导致膜的不稳定，破坏与膜相关的功能，如抑制与膜结合的ATP酶活性、降低胞内ATP水平、抑制细胞维持胞内pH的能力、破坏细胞膜的pH梯度等。丁醇 毒性对细胞膜的进一步影响是抑制糖和氨基酸的吸收，从而使代谢完全停滞。因此， 需要筛选出丁醇耐受能力高的菌株以用于生产，而筛选菌株的前提是建立一种高效 的检测菌株发酵产物含量的方法。目前溶剂(包括丙酮、丁醇、乙醇)产量测定一 般用高效液相色谱或气相色谱进行，但此方法存在工作量很大、分析时间较长的缺 点，对于一次筛选出较多的菌株，产物分析需数天时间。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法。 本专利技术的检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法，包括如下步骤1) 使发酵液中的丙酮与可溶性次碘酸盐反应，得到碘仿；2) 检测所述碘仿的量，根据所述碘仿的量得到所述丙酮的量；3) 根据所述丙酮的量，得到所述溶剂的量； 所述溶剂为丙酮和如下有机溶剂中的至少一种乙醇和丁醇。其中，所述使丙酮与可溶性次碘酸盐反应的方法为向所述发酵液中加入可溶性 碱、可溶性碘盐和碘。其中的丙酮可与次碘酸钠反应生成碘仿，碘仿不溶于水，可 通过酶标仪检测得到碘仿的0D值，然后根据0D值与丙酮浓度间的换算关系式得到 丙酮产量。本专利技术所述的溶剂产生菌产生的溶剂种类是已知的，且各产物与丙酮的质量存 在一定比例关系，且比例值是已知的，如C/o^WwmacetoZmO;/fcwmDSM1731的发 酵液中，丙酮、乙醇和丁醇的质量比为3: 1: 6 (Nutritional factors affecting the ratio of solvents producted by C7oWr/i//wm flceto6w^//cww, Applied and Environmental microbiology, 1986， 169-172)，因此，可以根据丙酮的量计算出其它溶剂的量，进 而得到总溶剂的产量。所述溶剂产生菌可以为丙酮丁醇梭菌和/或拜氏梭菌和/或糖丁酸梭菌，具体可 如C/as^ZAwm aceto6w/y/Zcwm DSM1731、 C7ost"V/z'wm ace/oZ w/)V/cwm ATCC824。实验证明，本专利技术的检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法，检测结果可靠 准确，与高效液相色谱法检测结果相当，但操作上比其简单、检测速度快，而且成 本低廉，因此，本专利技术方法可以实现高通量快速检测，在菌的溶剂产量检测中将会 有广阔的应用前景。 附图说明图i为丁醇标准品的高效液相色谱图。图2为乙醇标准品的高效液相色谱图。 图3为丙酮标准品的高效液相色谱图。图4为C/oWn'A'Mm flceto^0^'cwm DSM1731发酵液的高效液相色谱图。 图5为C/oy的'fi^m aceto6w^//cwm ATCC824发酵液的高效液相色谱图。 具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物 材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。 下述实施例中所使用的培养基及试剂如下酵母粉购自英国OXOID公司(目录号1023098)，蛋白胨购自英国OXOID公 司(目录号594566)，牛肉膏购自北京双旋微生物培养基制品厂，玉米粉购自普通 超市，碘化钾、碘均购买于sigma公司；种子微培养用的RCM培养基的组成为葡萄糖5.0g/L;酵母粉3.0g/L;蛋白 胨10.0 g/L;牛肉膏10.0 g/L;淀粉10.0 g/L;氯化钠5.0 g/L;醋酸钠3.0g/L;pH6.8， 溶剂为水。115匸条件下灭菌20分钟。发酵培养基CGM培养基的组成为葡萄糖50g/L;硫酸镁0.4g/L;硫酸锰0.01g/L;硫酸铁0.01 g/L;氯化钠1 g/L;酵母粉4 g/L;硫酸铵3g/L;磷酸二氢钾0.75g/L;磷酸氢二钾0.75 g/L，溶剂为水；pH6.9。 115。C条件下灭菌20分钟。含丁醇的RCM培养基的组成为向上述RCM培养基中添加丁醇，丁醇在RCM培养基中的终浓度为13-18 g/L。 115'C条件下灭菌20分钟。含丁醇的RCM固体培养基的组成为向上述RCM培养基中添加丁醇和琼脂，丁醇在RCM培养基中的终浓度为13-18 g/L，琼脂在RCM培养基中的终浓度为2% (质量百分含量)。115'C条件下灭菌20分钟。氢氧化钠溶液用水配制终浓度为2.5mol/L的氢氧化钠溶液。碘溶液先将2.6g碘化钾溶于水中，再加入1.3g碘，定容至100mL。pH 7.0的磷酸盐缓冲液将5.29 g KH2P04和13.94 g K2HP04溶于1L水中，pH7.0。生理盐水0.75% (质量百分含量)的氯化钠溶液。115。C条件下灭菌20分钟。 下述实施例中，高效液相色谱法测定溶剂产量的步骤为(1)样品前处理将发酵液以12000rpm的速度离心lmin，取上清液，将上清液用(X22iim滤膜过滤， 得到滤液，滤液进行后续检测。(2)色谱条件为Agilent 1200液相色谱仪，示差 检测器；BioRad Aminex HPX-87 H有机酸柱(30(P7.8mm),柱温15°C;上样量lO(il; 流动相为0.05 mM H2S04，流速0.5 ml/min。 丁醇、丙酮标准品均购自Sigma公司 (目录号依次为34867-2.5L， 650501-1L)，乙醇标准品购自sigma公司，产品目 录号为459828;在如上色谱条件下标准品的保留时间依次为丁醇38.8分钟、丙酮 26.8分钟、乙醇22.7分钟。实施例1、高通量检测C/oWW&wmflceto6wO;//cwmDSM1731发酵产生的溶剂产本实施例中所用的溶剂产生菌为ao^Wwm本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测溶剂产生菌发酵液中溶剂产量的方法，包括如下步骤： １）使发酵液中的丙酮与可溶性次碘酸盐反应，得到碘仿； ２）检测所述碘仿的量，根据所述碘仿的量得到所述丙酮的量； ３）根据所述丙酮的量，得到所述溶剂的量； 所述 溶剂为丙酮和如下有机溶剂中的至少一种：乙醇和丁醇。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张天瑞，张延平，李寅，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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