快速检测牛γ干扰素的试剂条及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种快速检测牛γ干扰素的试纸条及其制备方法。所说的试纸条由标记好对照线和检测线的ＮＣ膜、免疫金垫、样品垫、吸水滤纸和ＰＶＣ底板构成。其中所说的对照线的成分是抗鼠ＩｇＧ，检测线的成分是抗牛ｒ－ＩＦＮ单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。上述试纸条包括胶体金标记抗体、喷金、制作硝酸纤维素膜和组装的步骤。本发明专利技术的试纸条用于检测样本中的牛γ干扰素，从而可以用于牛结核病等疫病检测和诊断。该方法简便、快速，可以用肉眼直接观察，５－１０分钟即出结果，适用于基层各级兽医部门和出入境牛结核的快速大量筛选检测。该方法所需成本低廉，经济效益显著、应用前景广泛。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测牛Y干扰素的试剂条及其制备方法。
技术介绍
1.胶体金快速诊断技术的原理胶体金(Colloidal gold),是由金离子还原而成的许多单个金颗粒组成的悬乳液，胶体 金颗粒是有一个基础的晶核(原子金周围包含有11个金原子的二十面体)及包围在外的双 离子层构成，紧连在金核表面的是内层负离子(AuCl2一)，外层离子层H+则分散在胶体间 溶液(见图l)。金颗粒表面所包围的阴性电荷层，叫做zata电位，可以使胶体金颗粒之间 相互排斥而使悬浮液保持稳定。胶体金颗粒可以从5 150nm不等，制备胶体金仍基于还原法，常用的有鞣酸、柠檬酸 三钠、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等各种有机或无机化合物。还原剂的浓度和还原力越高， 那么所合成的胶体金颗粒就越小。胶体金2 5nm是桔黄色，10 20nm是酒红色，大颗粒 30 64nm是深红色。小分子的胶体金颗粒基本上是圆球形，30~80nm为偏心圆形。胶体金标记，实质上就是蛋白质等高分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的过程。蛋白 质与金颗粒的结合机制大概有以下几个方面带负电荷的金颗粒与蛋白质上的带正电的氨 基反应；其次，蛋白质通过疏水作用吸附于金颗粒表面；配位键是通过蛋白质中半胱氨酸 的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合。在标记后需要加入一定量的稳定剂，常用的稳 定剂有牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG)、明胶和干酪素等封闭金颗粒未被占据的位点以减少非特异性反应并稳定悬胶溶液。胶体金免疫快速诊断技术是在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术、 层析分析技术、胶体金标记技术和新材料技术基础上完善起来的一项固相标记新型免疫检 测技术。胶体金快速诊断技术是以胶体金作为示踪物或显色剂，将胶体金标记在抗体上， 再利用抗原抗体的血清学反应原理，把金颗粒连接到抗原上，当抗原抗体反应处达到一定密度时(即金颗粒l(^个/mm2)，出现肉眼可见的红色斑点。胶体金标记抗体实质是抗体被 吸附到胶体金颗粒表面的过程，且这种吸附属于物理吸附，对抗体的生物活性影响很小， 易获得较高的标记率；另外胶体金不属于生物活性物质，干扰检测结果的因素大大减少。 目前在检验中的应用主要是有2种形式穿流形式，又称为胶体金免疫渗滤试验 (Dot-immunogold filtration assay DIGFA);另一种为侧向横流形式，又称为胶体金免疫层析 试验(Gold immunochromatography assay, GICA)。胶体金免疫渗滤试验始于1985年，最初 以酶作为标记物。1989年Spielberg以胶体金为标记物成功检测了艾滋病病毒(HIV)抗体， 确立了免疫渗滤试验的基本技术，即主要以层析微孔膜(硝酸纤维素膜，称NC膜)为固相 载体，在NC膜上固定已知的抗原或抗体，封闭包被后，将其装入免疫渗滤装置(塑料小盒) 中，加待测样品，洗涤后用胶体金探针检测相应的抗原或抗体。塑料小盒一般为扁平形， 里面装满吸水材料，盒分为底和盖两部分，盖的中央有一直径0.4 0.8cm孔，小孔下紧贴 吸水垫料放置硝酸纤维素膜。胶体金免疫层析技术原理与免疫渗滤技术基本一致，只是将原来的渗滤改为层析。它 同样以硝酸纤维素膜为固相载体，通过毛细管作用使样品溶液在层析条上移动，并同时使 样品中的待测物质与层析材料上待测物的受体发生高特异高亲和性的免疫反应。层析过程 中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域(检测带)，通过直接可目测的标记物胶 体金而得到直观的实验现象(如显色)，而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自 动分离的目的。 2.牛结核病的诊断牛结核病是一种由牛分支杆菌和结核分支杆菌所引起的人畜共患的慢性消耗性传染 病；也是世界动物卫生组织规定必须强制报告的疫病。据世界卫生组织(WHO)统计资 料,1986-1990年41.5%的发展中国家和25%的发达国家结核病的疫情在上升。1993年， WHO宣布人的结核处于全球紧急状态。据估计,结核病每年在世界范围内造成多至300万人 的死亡。研究表明在圣地亚哥的1931个结核病例中，分离的菌株中有7%被确定为牛分支杆 菌；而从儿童中分离的33%的菌株是牛分支杆菌。所以WHO专家又指出:"除非扑灭牛结核 病,否则人类结核病的控制是不会成功的"。因此，预防和根除牛结核病是摆在兽医科技工 作者面前的严峻课题。控制牛结核病不仅关系到畜牧业的持续发展，而且直接影响人类健 康。要控制牛结核病的发生与流行，必须加强对该病的诊断学研究,以便为控制和最终消灭牛 结核病提供技术保证。4牛结核病血清学诊断试验由于其敏感性低、特异性较差，迄今为止还未被医学和兽医 学实验室用于常规诊断。细菌学方法用于诊断牛结核病很费时，且检出率低、灵敏度差， 不能满足临床要求。 一些牛结核特异性基因已被确认,并建立了分子生物学实验室鉴定技 术，但目前远不能用于基层推广应用。由于牛结核病是一类以细胞免疫反应为主要特征的 疾病，因此在该病的诊断中应以T细胞反应机制为基础。牛结核病的结核菌素诊断试验就 是以细胞免疫反应为基础的一种诊断技术。自从1891年Koch首先提出以来，该技术虽然 在结核病诊断中被广泛应用，但也暴露出诸如灵敏度不高、检测不快速以及影响因素多等 许多问题。在国外，目前建立了一种新颖的用于诊断牛结核病的牛Y干扰素的ELISA测定技 术。该方法通过全血培养、牛牛分支杆菌抗原PPD作为刺激物，利用牛Y干扰素特异性抗 体建立的ELISA方法检测全血培养中释放出的Y干扰素，从而对牛结核病进行诊断。而本发 明在于利用胶体金试纸条这种简便快速，适于基层的操作方法检测牛干扰素，迅速诊断牛 结核病。作为一种全新的牛结核病诊断技术，国外经过近十年的研究证明检测Y干扰素试验 具有以下优点。(1) 灵敏度髙高灵敏的诊断技术对牛结核病的控制与消灭尤为重要。用，IFN试验和结 核菌素试验对已知感染牛结核的牛群的比较检测表明，Y-IFN试验的敏感性为93.6n/0, 而结核菌素试验只为65.6%。(2) 特异强澳大利亚对非结核感染区的6000头牛试验后得出Y干扰素试验的特异性为 96.3%。爱尔兰初步应用该技术也表明，牛丫干扰素试验有98.5%的特异性。同样，澳 大利亚研究表明，人丫干扰素试验的敏感性和特异性也分别达到90%和98%左右。(3) 快速性"/千扰素试验报告可在24h内完成，而结核菌素试验则需要72h后得出结论； 而且结核菌素试验中，动物往往由于抗原没有进入体内而被延误诊断。Y干扰素试验 还具有可随时重复性；而结核菌素试验在检测后60天内，牛不能再次用结核菌素试 验对其进行检测。(4) 标准化由于Y干扰素试验采用的是全血培养，结果判定明确，易标准化。目前，国 外已经有相应的ELISA试剂盒生产，但试纸条方法还没有。由于用于牛结核病诊断的Y干扰素试验具有以上优点，牛Y干扰素检测的广泛临床试验已 在世界上许多国家(包括澳大利亚、爱尔兰、新西兰、阿根廷、西班牙、意大利和美国)完 成。在澳大利亚j干扰素试验已被农业委员会确认为牛结核的诊断试验，被称为自20世 纪结核菌素试验问世以来诊断牛结核病的最新诊断试验方法。因此，Y干扰素试验的发展是牛结核病诊断的一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测牛γ干扰素的试纸条，其特征在于：由标记好对照线和检测线的ＮＣ膜、免疫金垫、样品垫和吸水滤纸和ＰＶＣ底板构成，样品垫、免疫金垫、ＮＣ膜和吸水滤纸依次设置在ＰＶＣ底板上，并且它们的接头处有叠压，使层析能顺利进行；其中所说的对照线的成分是抗鼠ＩｇＧ，检测线的成分是抗牛ｒ－ＩＦＮ单克隆抗体；所说的免疫金垫是载有胶体金标记的单克隆抗体的玻璃棉。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：秦爱建，邵红霞，金文杰，赵士学，尹天燕，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]