本发明专利技术涉及一种肠道病毒荧光免疫层析检测试纸，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、标记抗体垫、反应膜和吸水垫，其特征在于所述标记抗体垫包埋有一种或多种肠道病毒的荧光标记单克隆抗体；所述反应膜上具有一条或多条检测带和一条质控带，每条检测带上固定有一种肠道病毒的单克隆抗体，质控带固定有羊抗鼠ＩｇＧ抗体。被检测的肠道病毒包括诺瓦克病毒、肠道腺病毒、星状病毒、轮状病毒中的一种或多种，通过荧光素或荧光微球标记抗体的特异性反应并应用专用仪器检测能够实现定性或定量检测的目的。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种免疫荧光层析检测试纸，具体地说是一种用于 检测肠道常见病毒的免疫荧光层析检测试纸条，可检测的肠道病毒 包括诺瓦克病毒、肠道腺病毒、星状病毒和轮状病毒，该试纸可用 于流行病监测、临床检验等相关领域。
技术介绍
免疫层析方法是以胶体金、荧光素、酶等作为标记物，利用特 异性抗原抗体反应和标记物的特性，对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术。自Faulk与Taylor在1971年创立胶 体金标记技术以来，Geoghegan一l应用免疫金技术检测B淋巴细胞 表面抗原，建立了光镜水平的免疫金技术(IGS)。 Danscher在此基础 上改进并发展了用银显影液增强光镜金颗粒可见性的免疫金染色法 (IGSS)。 Holgate也对此法进行了改进。近年来，胶体金技术亦被引 入免疫化学检验领域，称为金标记免疫吸附试验(gold labeled immunosorbent assay, GLISA)。由于胶体金作为标记物时，其试纸 条的操作简便，不需要借助较复杂的监测仪器等优越性，因而在免 疫组织化学检测中受到了广泛的重视和应用，但一般情况下其检测 灵敏度较低。以酶类(生物素酶、碱性磷酸酶等)作为标记物时， 涉及加样、温浴、洗涤、显色、终止等多个步骤，耗时较长，对操 作人员和环境的要求较高；以荧光素作为标记物时，借助荧光检测 仪可以 一定程度上提高检测的灵敏度。腹泻是人类尤其是儿童、老人及免疫缺陷者的一种常见病和多 发病，其中病毒性腹泻占70% ~80%，是导致儿童死亡的重要原因。其中轮状病毒(Rotavirus, RV)、星状病毒(Astrovirus, AstV)、诺 瓦克病毒(Norwalk virus, NV)及肠道腺病毒(Enteric Adenovirus, EAdV)等四种肠道病毒最为常见，3岁前几乎所有儿童都经历过上 述腹泻病毒的感染。轮状病毒引起的腹泻是病毒性腹泻的主要因素，40 % -60 %的腹 泻由轮状病毒引起，全球每年约有1.4亿人发生轮状病毒腹泻，其发 病率和严重程度居秋冬季腹泻的首位，并导致大约80万儿童死亡， 严重的轮状病毒感染主要见于6~24个月婴幼儿。肠道腺病毒也是 病毒性腹泻的重要病原，主要症状为腹泻，水样便或稀便，腹泻次 数较多，病程7-14天，排毒时间10-14天，可伴有发热，呕吐和 呼吸道症状，病情相对较轻，少数也能导致严重脱水致死。星状病 毒与轮状病毒相似，以2岁以下儿童多发，可以散发，也可以暴发 流行。诺瓦克病毒分布广泛，可导致成人和儿童的急性腹泻的病毒， 是除轮状病毒外引起腹泻的最主要的病毒病原，日本的流行病学调 查显示诺瓦克病毒感染率已超过轮状病毒。在美国，成人非细菌性 胃肠炎的爆发中有42%由该类病毒所引起，我国还缺乏流行病学调 查。目前临床上仍无针对这四种肠道病毒的特效治疗药物，虽然有 轮状病毒疫苗研制的报道，但其效果还需要观察，所以预防、控制 病毒传染显得尤为重要。细菌、寄生虫及食物中毒等原因也能引起 腹泻，临床症状相仿，但与病毒性腹泻的治疗方案不一样。有报道 发现双重病毒或多种病毒感染的腹泻，其症状更严重，病情进展快， 导致死亡的风险更高。由于肠道传染病的临床表现和常用的辅助检查缺乏明显的特异 性，因此存在着在疾病早期病原体诊断不明确的危险因素，从而存在着疾病早期滥用抗生素、生病期延长而增加患者痛苦和经济负担 的客观因素。因此，对此类疾病的深入研究，研制快速准确的诊断 技术，对预防疾病的发生和减少死亡率，指导临床对症治疗和避免 抗生素滥用有重要意义。应用高灵敏度的、快速和特异的免疫荧光层析方法进行肠道传 染病的病原学诊断，有利于在疾病症状出现的早期就确定引起肠道 传染病的病原体。有利于在疾病早期针对性进行有效的抗生素治疗， 缩短疾病的病程，减轻患者的痛苦和经济负担。对肠道病毒及时而 准确的病原学诊断，有利于对肠道病毒的流行病学进行研究，指导 在疾病流行的初期进行预防，从而能极大程度的降低肠道传染病的 流行范围和程度，降低肠道传染病对社会的危害。目前对于肠道病毒的检测多釆用免疫学检测，传统的免疫检测 有乳胶凝集试验(LA)、免疫标记技术[包括酶联免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、免疫金染色法(immunogold staining, IGS)等技术], 随着新标记物的应用以及固相载体技术和抗体制备技术的发展，免 疫定量技术如时间分辨荧光免疫测定(time-resolved fluoro-immunoassay, TR-IFMA或TrFIA)和定量乳胶凝集试验 (quantitative latex agglutination technique, QLAT)等免疫学新技术相 继用于病原体的检测，简化了检测步骤，也提高了免疫学方法检测 的特异性和灵敏度。可以用于肠道病毒多检的免疫荧光层析检测试纸条法通过不同病原体的特异性单克隆抗体，来对肠道病毒进行病 原学诊断，在疾病发生发展的早期就可以进行诊断，从而具有显而 易见的临床诊断意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种常见肠道病毒的免疫荧光层析快速 检测试纸，其具有快速、有效而简便的特点，涉及的病原体为轮状 病毒(RV)、星状病毒(AstV)、诺瓦克病毒(NV)及肠道腺病毒(EAdV)中的一种或多种。本专利技术的另 一 个目的在于提供制备上述检测试纸的方法。 本专利技术的免疫荧光层析快速检测试纸包括底板、附着在底板上 依次紧密相连的样品吸收垫、标记抗体垫、反应膜和吸水垫。其中 所述标记抗体垫包埋有一种或多种肠道病毒的荧光标记单克隆抗体；所述反应膜上具有一条或多条检测带和一条质控带，每条检测带上固定有一种肠道病毒的单克隆抗体，检测带的条数以及固定的 肠道病毒单克隆抗体与标记抗体垫包埋的标记抗体相适应，质控带 固定有能与荧光标记单克隆抗体特异结合的抗抗体。其中，所述的肠道病毒单克隆抗体为轮状病毒单克隆抗体、肠 道腺病单克隆抗体、星状病毒单克隆抗体或诺瓦克病毒单克隆抗体 中的一种或多种。其中，制备轮状病毒单克隆抗体的免疫原优选为轮状病毒VP6蛋白；制备肠道腺病毒单克隆抗体的免疫原优选为腺 病毒40/41型六邻体蛋白(hexon);制备星状病毒单克隆抗体的免疫 原优选为I型星状病毒CP蛋白；制备诺瓦克病毒单克隆抗体的免疫 原优选为诺瓦克病毒VP1蛋白。上述的免疫原是釆用大肠杆菌原核 表达系统表达，利用分子生物学技术扩增出所需的核酸序列，将核 酸连接到表达质粒载体上，转染到大肠杆菌中诱导表达，再通过镍 亲和柱纯化出目的蛋白。釆用弗氏免疫佐剂与纯化目的蛋白乳化物 免疫实验动物Balb/c小鼠，每只注射量为50jag蛋白，免疫部位为 腹服沟和腹腔，免疫间隔期为14天，免疫4次(第一次选用的佐剂 为弗氏完全佐剂，后三次为弗氏不完全佐剂)；釆取小鼠血清测试 Elisa抗体效价，选取效价大于l: 5000的小鼠进行加强免疫，蛋白 免疫量为lOOiag/只，免疫部位为脾脏，3天后可进行融合试验。无 菌取其脾脏细胞并与SP2/0—Ag14骨髓瘤细胞杂交融合，融合剂 为PEG3350。用间接ELISA方法筛选阳性克隆，通过有限稀释法筛 选出特异分泌肠道病毒重组蛋白的单克隆细胞株。以体内诱生法进行腹水制本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种肠道病毒免疫荧光层析快速检测试纸，包括底板、附着在底板上依次紧密相连的样品吸收垫、标记抗体垫、反应膜和吸水垫，其特征在于所述标记抗体垫包埋有一种或多种肠道病毒的荧光标记单克隆抗体；所述反应膜上具有一条或多条检测带和一条质控带，每条检测带上固定有一种肠道病毒的单克隆抗体，检测带的条数以及固定的肠道病毒单克隆抗体与标记抗体垫包埋的标记抗体相适应，质控带固定有能与荧光标记单克隆抗体特异结合的抗抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨奇，周荣，王长兵，王海，
申请(专利权)人：北京博晖创新光电技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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