【技术实现步骤摘要】
基于在体基因敲除的视网膜色素变性猕猴模型构建方法
本专利技术涉及分子生物学领域。具体而言，本专利技术涉及通过基因编辑技术进行基因敲除来实现动物疾病造模。
技术介绍
自2013年麻省理工学院张锋教授研究并开发CRISPR/Cas9基因编辑技术以来(PMID：24157548)，此基因编辑技术被广泛应用于哺乳动物基因改造，其中便包括遗传性疾病动物造模。视网膜色素变性(RP)是最广泛的遗传性致盲疾病之一，其致病基因繁多，单基因突变致病也占据很大的比例，如RHO、USH2A、RP1、PRPF31等基因的突变都会导致显性或隐性RP发病(PMID：23701314)。目前对于RP的研究所使用的动物集中于啮齿类动物疾病模型，如KrzysztofPalczewski构建的P23H基因敲入小鼠模型等(PMID：21224384)。然而小鼠与人类进化相距较远，存在明显的视网膜感光细胞分布及生存能力差异，不能很好地模拟人类RP疾病。这使人自然想到利用非人灵长类动物构建RP动物模型。虽然如此，由于极长的繁殖周期及产子数量极少，构建转基因猕猴RP模型...
【技术保护点】
1.一种敲除，优选在体敲除哺乳动物感光细胞中视网膜色素变性致病基因的方法，其包括将一个或多个，例如3个靶向所述致病基因的sgRNA的编码序列，优选SEQ ID NO:3-5所示的编码序列和CRISPR酶的编码序列构建在空的病毒表达载体中，用构建的病毒表达载体转染宿主细胞并表达和包装为活性病毒，并用所述活性病毒感染所述感光细胞，从而实现所述感光细胞中所述视网膜色素变性致病基因的敲除，其中所述sgRNA的编码序列的每一个与所述致病基因的序列互补；所述视网膜色素变性致病基因为例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因，优选RHO基因；所述哺乳动物优选为灵长类动物，更优选猕...
【技术特征摘要】
1.一种敲除，优选在体敲除哺乳动物感光细胞中视网膜色素变性致病基因的方法，其包括将一个或多个，例如3个靶向所述致病基因的sgRNA的编码序列，优选SEQIDNO:3-5所示的编码序列和CRISPR酶的编码序列构建在空的病毒表达载体中，用构建的病毒表达载体转染宿主细胞并表达和包装为活性病毒，并用所述活性病毒感染所述感光细胞，从而实现所述感光细胞中所述视网膜色素变性致病基因的敲除，其中所述sgRNA的编码序列的每一个与所述致病基因的序列互补；所述视网膜色素变性致病基因为例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因，优选RHO基因；所述哺乳动物优选为灵长类动物，更优选猕猴科，还更优选猕猴属，最优选猕猴种；所述病毒表达载体为例如腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的表达载体；所述CRISPR酶为例如Cas9或SaCas9。
2.权利要求1所述的方法，其中所述空的病毒表达载体为腺相关病毒病毒载体，并且将所述腺相关病毒表达载体和辅助载体转染到所述宿主细胞中并表达和包装为腺相关病毒，所述腺相关病毒表达载体优选为衍生自AAV6的腺相关病毒，更优选为ShH10。
3.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为293T细胞。
4.一种病毒表达载体，其通过将一个或多个，例如3个靶向视网膜色素变性致病基因，例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因的sgRNA的编码序列和CRISPR酶的编码序列构建在空的病毒表达载体中得到，其中所述sgRNA的编码序列的每一个与所述致病基因的序列互补；所述病毒表达载体为例如腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛天，李守振，章梅，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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