基于在体基因敲除的视网膜色素变性猕猴模型构建方法技术

本发明专利技术利用CRISPR基因编辑系统与AAV转导系统，直接在成年猕猴视网膜感光细胞中敲除RHO基因，以模拟遗传性RHO突变引起的视网膜变性退化，在3‑6个月的时间构建猕猴视网膜色素变性(RP)动物模型。此模型可以推动人类RP疾病的研究与治疗。

【技术实现步骤摘要】
基于在体基因敲除的视网膜色素变性猕猴模型构建方法
本专利技术涉及分子生物学领域。具体而言，本专利技术涉及通过基因编辑技术进行基因敲除来实现动物疾病造模。
技术介绍
自2013年麻省理工学院张锋教授研究并开发CRISPR/Cas9基因编辑技术以来(PMID：24157548)，此基因编辑技术被广泛应用于哺乳动物基因改造，其中便包括遗传性疾病动物造模。视网膜色素变性(RP)是最广泛的遗传性致盲疾病之一，其致病基因繁多，单基因突变致病也占据很大的比例，如RHO、USH2A、RP1、PRPF31等基因的突变都会导致显性或隐性RP发病(PMID：23701314)。目前对于RP的研究所使用的动物集中于啮齿类动物疾病模型，如KrzysztofPalczewski构建的P23H基因敲入小鼠模型等(PMID：21224384)。然而小鼠与人类进化相距较远，存在明显的视网膜感光细胞分布及生存能力差异，不能很好地模拟人类RP疾病。这使人自然想到利用非人灵长类动物构建RP动物模型。虽然如此，由于极长的繁殖周期及产子数量极少，构建转基因猕猴RP模型仍然存在极大的限制，大量广泛地使用此类猕猴遗传RP模型更是不切实际，严重阻碍RP疾病研究及治疗的发展。那么，在较短的时间和较少的实验成本下，创造能很好模拟人类遗传性视网膜色素变性的猕猴动物模型，成为一个亟待解决的问题。利用CRISPR基因编辑技术，在成年猕猴感光细胞中实现在体基因敲除，有希望快速制造大量可用的RP模型动物，用于以后RP疾病的病理机制及治疗开发研究。
技术实现思路
>本申请专利技术人通过长期研究解决了本领域中存在的问题。以最广泛的RP致病基因RHO为例，设计并实现了利用CRISPR基因编辑系统与AAV转导系统，直接在成年猕猴视网膜感光细胞中敲除RHO基因，以模拟遗传性RHO突变引起的视网膜变性退化，在3-6个月的时间构建猕猴视网膜色素变性(RP)动物模型。此模型可以推动人类RP疾病的研究与治疗。采用本专利技术的方案，同样适用其它RP相关致病基因(如USH2A、RP1、PRPF31)的敲除进而构建猕猴视网膜色素变性(RP)动物模型。具体而言，本专利技术通过如下技术方案解决了本领域的技术问题。1.一种敲除，优选在体敲除哺乳动物感光细胞中视网膜色素变性致病基因的方法，其包括将一个或多个，例如3个靶向所述致病基因的sgRNA的编码序列，优选SEQIDNO:3-5所示的编码序列和CRISPR酶的编码序列构建在空的病毒表达载体中，用构建的病毒表达载体转染宿主细胞并表达和包装为活性病毒，并用所述活性病毒感染所述感光细胞，从而实现所述感光细胞中所述视网膜色素变性致病基因的敲除，其中所述sgRNA的编码序列的每一个与所述致病基因的序列互补；所述视网膜色素变性致病基因为例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因，优选RHO基因；所述哺乳动物优选为灵长类动物，更优选猕猴科，还更优选猕猴属，最优选猕猴种；所述病毒表达载体为例如腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的表达载体；所述CRISPR酶为例如Cas9或SaCas9。2.项目1所述的方法，其中所述空的病毒表达载体为腺相关病毒病毒载体，并且将所述腺相关病毒表达载体和辅助载体转染到所述宿主细胞中并表达和包装为腺相关病毒，所述腺相关病毒表达载体优选为衍生自AAV6的腺相关病毒，更优选为ShH10。3.项目1-2任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为293T细胞。4.一种病毒表达载体，其通过将一个或多个，例如3个靶向视网膜色素变性致病基因，例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因的sgRNA的编码序列和CRISPR酶的编码序列构建在空的病毒表达载体中得到，其中所述sgRNA的编码序列的每一个与所述致病基因的序列互补；所述病毒表达载体为例如腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的表达载体；所述CRISPR酶为例如Cas9或SaCas9。5.一种病毒，其能够敲除哺乳动物感光细胞中视网膜色素变性致病基因，例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因，其中所述病毒通过将项目4所述的病毒表达载体在宿主细胞中表达并包装得到。6.项目5所述的病毒，其中所述空的病毒表达载体为腺相关病毒病毒载体，并且将所述腺相关病毒表达载体和辅助载体转染到所述宿主细胞中并表达和包装为腺相关病毒，所述腺相关病毒表达载体优选为衍生自AAV6的腺相关病毒，更优选为ShH10。7.项目5-6任一项所述的病毒，其中所述宿主细胞为293T细胞。8.一种组合物，其包含项目5-7任一项所述的病毒和药学上可接受的载体。9.一种试剂盒，其包含项目5-7任一项所述的病毒或项目8所述的组合物。10.项目5-7任一项所述的病毒或项目8所述的组合物或项目9所述的试剂盒在感染哺乳动物感光细胞以敲除，例如在体敲除所述哺乳动物感光细胞中视网膜色素变性致病基因中的用途，其中所述视网膜色素变性致病基因为例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因；所述哺乳动物优选为灵长类动物，更优选猕猴科，还更优选猕猴属，最优选猕猴种。11.项目5-7任一项所述的病毒或项目8所述的组合物或项目9所述的试剂盒在制备视网膜色素变性的哺乳动物模型中的用途，其中所述哺乳动物优选为非人灵长类动物，更优选猕猴科，还更优选猕猴属，最优选猕猴种。附图说明图1.靶向RHO基因的sgRNAs示意图。图2.本文所用AAV载体示意图。图3.猕猴视网膜下腔注射示意图。图4.在体基因编辑形成的Indels。图5.猕猴视网膜免疫荧光染色显微成像。图6.猕猴视网膜在体光学相干断层扫描(OCT)成像。图7.猕猴视网膜感光细胞透射电子显微镜成像。图8.猕猴视网膜体外视网膜电图记录。具体实施方式为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本专利技术作进一步的详细说明。本专利技术为了解决了现有技术的问题。以最广泛的RP致病基因RHO为例，设计并实现了利用CRISPR基因编辑系统与AAV转导系统，直接在成年猕猴视网膜感光细胞中敲除RHO基因，以模拟遗传性RHO突变引起的视网膜变性退化，在3-6个月的时间构建猕猴视网膜色素变性(RP)动物模型。此模型可以推动人类RP疾病的研究与治疗。具体
技术实现思路
为：首先我们设计了三个靶向RHO基因的sgRNA，如图1所示，以高效在体敲除猕猴RHO基因。本专利技术采用SaCas9，以使SaCas9和sgRNA可以构建在同一个表达载体中，此设计非本专利技术首创，为直接应用张锋pX602质粒。(1)中所述三个sgRNAs分别构建在pX602载体U6启动子之后，如图2所述。三个AAV载体被分别与ShH10和pHelper两个辅助质粒转染293T细胞，包装出三个高滴度的AAV病毒(5E12/ml)。此AAV病毒为核心产品，可以通过视网膜下腔注射高效感染感光细胞，并敲除RHO基因。(2)中所述病毒通过视网膜下腔注射方式直接用在成年猕猴眼中，三点注射，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种敲除，优选在体敲除哺乳动物感光细胞中视网膜色素变性致病基因的方法，其包括将一个或多个，例如3个靶向所述致病基因的sgRNA的编码序列，优选SEQ ID NO:3-5所示的编码序列和CRISPR酶的编码序列构建在空的病毒表达载体中，用构建的病毒表达载体转染宿主细胞并表达和包装为活性病毒，并用所述活性病毒感染所述感光细胞，从而实现所述感光细胞中所述视网膜色素变性致病基因的敲除，其中所述sgRNA的编码序列的每一个与所述致病基因的序列互补；所述视网膜色素变性致病基因为例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因，优选RHO基因；所述哺乳动物优选为灵长类动物，更优选猕猴科，还更优选猕猴属，最优选猕猴种；所述病毒表达载体为例如腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的表达载体；所述CRISPR酶为例如Cas9或SaCas9。/n

【技术特征摘要】
1.一种敲除，优选在体敲除哺乳动物感光细胞中视网膜色素变性致病基因的方法，其包括将一个或多个，例如3个靶向所述致病基因的sgRNA的编码序列，优选SEQIDNO:3-5所示的编码序列和CRISPR酶的编码序列构建在空的病毒表达载体中，用构建的病毒表达载体转染宿主细胞并表达和包装为活性病毒，并用所述活性病毒感染所述感光细胞，从而实现所述感光细胞中所述视网膜色素变性致病基因的敲除，其中所述sgRNA的编码序列的每一个与所述致病基因的序列互补；所述视网膜色素变性致病基因为例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因，优选RHO基因；所述哺乳动物优选为灵长类动物，更优选猕猴科，还更优选猕猴属，最优选猕猴种；所述病毒表达载体为例如腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的表达载体；所述CRISPR酶为例如Cas9或SaCas9。


2.权利要求1所述的方法，其中所述空的病毒表达载体为腺相关病毒病毒载体，并且将所述腺相关病毒表达载体和辅助载体转染到所述宿主细胞中并表达和包装为腺相关病毒，所述腺相关病毒表达载体优选为衍生自AAV6的腺相关病毒，更优选为ShH10。


3.权利要求1-2任一项所述的方法，其中所述宿主细胞为293T细胞。


4.一种病毒表达载体，其通过将一个或多个，例如3个靶向视网膜色素变性致病基因，例如，RHO、USH2A、RP1、PRPF31基因的sgRNA的编码序列和CRISPR酶的编码序列构建在空的病毒表达载体中得到，其中所述sgRNA的编码序列的每一个与所述致病基因的序列互补；所述病毒表达载体为例如腺相关病毒、腺病毒或慢病毒的表达...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛天，李守振，章梅，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34