本发明专利技术属于一种临床检测技术，主要用于腹泻病人产毒性大肠杆菌的检测。其特征为以８００个碱基对Ⅰ型不耐热肠毒素（ＬＴ－［１］）ＤＮＡ片段为模板，在ＫＬＥＮＯＷ酶的作用下，地高辛素标记ＬＴ－［１］ＤＮＡ探针；然后将样本滤膜经ＲＮＡ酶Ａ和蛋白酶Ｋ消化处理后，进行核酸杂交，在适当条件下用地高辛素标记ＬＴ－［１］ＤＮＡ探针检测产ＬＴ－［１］的产毒性大肠杆菌。其具有高度特异性和敏感性、操作方便、检测时间短、性质稳定等优点。（*该技术在2009年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于一种临床检测技术，主要用于腹泻病人产毒性大肠杆菌的检测。产毒性大肠杆菌是引起人类感染性腹泻的主要病原菌，其可产生多种肠毒素，其中最主要一种为I型不耐热肠毒素(LT1)，采用核酸杂交技术可检测到LT1编码基因。最初人们采用同位素标记LT1DNA探针用于核酸杂交(Moseley SL，et al J Infect Dis 1982，145∶863)来检测产毒性大肠杆菌，虽然特异性和敏感性较高，但同位素半衰期短，操作时防护及同位素处理等缺点限制其常规应用。近年来，人们研究非同位素标记探针来检测产毒性大肠杆菌，主要应用生物素(Bi-alkowska Hobrzanska H.J clin Microbiol 1987，25∶338)，尽管生物素标记LT1探针避免了同位素探针的缺点，但其敏感性低于前者，而且在应用于临床标本的检测时还未解决好特异性的问题。本专利技术的目的在于提供一种具有高度特异性和敏感性、操作方便、检测时间短的地高辛素标记LT1DNA探针的制备及检测方法。本专利技术的任务是这样完成的，以800个碱基对LT1DNA片段为模板，在KLENOW酶的作用下，地高辛素标记核苷酸(地高辛素-dUTP)掺入新合成的DNA链，从而形成地高辛素标记LT1DNA探针;将腹泻病人的粪便标本点于硝酸纤维素滤膜上，经RNA酶A和蛋白酶K消化处理后，在适当条件下用该探针进行杂交检测产LT1的产毒性大肠杆菌。下面结合实施例对本专利技术作详细说明。一.地高辛素标记LT1DNA探针的制备1.取若干ulLT1DNA(0.1～1ug)，95～100℃水浴5～10分钟，迅速冷缺;2.在水浴中加入1～2ul六核苷酸混合物、1～2ul带地高辛素标记的核苷酸混合物(含地高辛素-dUTP0.35mM/L，PH6.5)，加无菌去离子水至反应体积19ul，再加1ulKLENOW酶。3.混匀后在25～37℃水浴1～18小时;4.加2ul0.2M乙二胺四乙酸二钠(EDTA，PH8.0)，终止反应;5.加2ul4M氯化锂、60ul无水乙醇沉淀标记的DNA，在-20℃放置2～14小时;6.高速离心，用70%乙醇洗涤沉淀物;7.用50ul10∶1TE溶解沉淀物。经过上述步骤，即制成地高辛素标记LT1DNA探针。二.核酸杂交下述实验溶液用量以100cm2硝酸纤维膜为准。1.滤膜准备(1)将无菌硝酸纤维素滤膜平放LB培养基(每100ml含胰蛋白胨1g、酵母粉0.5g、氯化钠1g和琼脂1.5g)上;(2)取样本(粪便或细菌)点膜，37℃培养过夜;(3)将滤膜转移到为下述液体饱和的双层滤纸上0.5N氢氧化钠2×10分钟1MTris-HCl(PH7.6)2×2分钟1MTris-HCl(PH7.6)～1.5M氯化钠10分钟(4)凉干滤膜后80℃2小时烘烤;(5)滤膜浸泡于10∶1TE37℃5分钟后用40～200ug/mlRNA酶A(用10∶1TE稀释)25～37℃消化1～2小时;用10∶1TE、TES各洗涤一次;(6)用50～1000ug/ml蛋白酶K25～50℃消化1～2小时，TES25～50℃洗涤2×5分钟，凉干备用。2.杂交置硝酸纤维素滤膜于杂交袋，加10ml预杂交液(5×SSC、0.5～5%封闭液、0.02～0.09% SDS，其中1×SSC＝0.15M氯化钠-0.015M柠檬酸钠)68℃水浴2～5小时;倒出预杂交液加2.5ml杂交液(5×SSC、0.5～5%封闭剂、0.02～0.09% SDS、2～200ng/ml新鲜变性地高辛素LT1探针)68℃水浴2～12小时。3.洗膜50ml2×SSC-0.1%SDS洗膜3×5分钟，50ml0.1SSC-0.1%SDS65℃洗膜3×15分钟。4.检测(1)20ml1号液(0.1MTris-HCl、PH7.5-0.15M氯化钠)浸泡滤膜1分钟;(2)30ml2号液(含0.5～5%封闭剂的1号液)封膜20～40分钟;(3)1号液洗1次;(4)按1∶5000比例用1号液稀释抗地高辛素抗体-碱性磷酸酶复合物至150mu/ml，用10ml抗体-酶复合物稀释液孵育滤膜20～40分钟;(5)100ml1号液洗膜3×15分钟;(6)20ml3号液(0.1MTris-HCl、PH9.5-0.1M氯化钠-0.05M氯化镁)浸泡2分钟;(7)10ml显色液在暗处孵育滤膜2～24小时;(8)20ml4号液(10∶1TE、PH8.0)洗膜5分钟终止反应观察结果。凉干滤膜保存。本专利技术的优点为(1)具有高度特异性和敏感性，在DNA斑点试验中可检测0.1pg质粒DNA，在菌落原位杂交试验中可检测12个细菌/ml，在粪便斑点杂交试验中可检测24个细菌/ml，且检测结果无假阳性和假阴性;(2)检测时间短，仅需20～30小时;(3)性质稳定，在低温条件下可长期保存(1～2年);(4)操作安全，无需防护。权利要求1.一种地高辛素标记Ⅰ型不耐热肠毒素(LT1)DNA探针的制备及检测方法，其特征为(1)以800个碱基对LT1DNA片段为模板，在KLENOW酶的作用下，地高辛素标记核苷酸掺入新的DNA链，形成地高辛素标记LT1DNA探针；(2)将样本滤膜经RNA酶A和蛋白酶K消化处理后，进行核酸杂交，在适当条件下用地高辛素标记LT1DNA探针检测产LT1的产毒性大肠杆菌。2.根据权利要求1所述的地高辛素标记LT1DNA探针的制备及检测方法，其特征为地高辛素标记LT1DNA探针的制备包括以下步骤(1)取若干ulLT1DNA(0.1～1ug)，95～100℃水浴5～10分钟，迅速冷却;(2)在水浴中加入1～2ul六核苷酸混合物、1～2ul带地高辛素标记的核苷酸混合物(含地高辛素-dUTP0.35mM/L，PH6.5)，加无菌去离子水至反应体积19ul，再加1ulKLENOW酶;(3)混匀后在25～37℃水浴1～18小时;(4)加2ul0.2M乙二胺四乙酸二钠(EDTA，PH8.0)，终止反应;(5)加2ul4M氯化锂、60ul无水乙醇沉淀标记的DNA，在-20℃放置2～14小时;(6)高速离心，用70%乙醇洗涤沉淀物;(7)用50ul10∶1TE〔10mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)、1mMEDTA、PH8.0〕溶解沉淀物。3.根据权利要求1所述的地高辛素标记LT1DNA探针的制备及检测方法，其特征为样本滤膜在碱性裂解后须经下述处理10∶1TE(10mM Tris-HCl、10mM EDTA、PH8.0)37℃ 5分钟，40～200ug/ml RNA酶A(用10∶1TE稀释)25～37℃消化1～2小时，用10∶1TE、TES〔10mMTris-HCl、PH7.8-5mM EDTA-0.5%十二烷基磺酸钠(SDS)〕各洗涤一次;再用50～1000ug/ml蛋白酶K25～50℃消化1～2小时，TES25～50℃洗涤2×5分钟。(4)根据权利要求1所述的地高辛素标记LT1DNA探针的制备及检测方法，其特征为封闭剂浓度在预杂交液、杂交液和2号液中为0.5～5%。全文摘要本专利技术属于一种临床检测技术，主要用于腹泻病人产毒性大肠杆菌的检测。其特征为以800个碱基对I型不耐热肠毒素(LT文档编号C12Q1/04GK1039444SQ89106198本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种地高辛素标记Ⅰ型不耐热肠毒素（ＬＴ↓［１］）ＤＮＡ探针的制备及检测方法，其特征为：（１）以８００个碱基对ＬＴ↓［１］ＤＮＡ片段为模板，在ＫＬＥＮＯＷ酶的作用下，地高辛素标记核苷酸掺入新的ＤＮＡ链，形成地高辛素标记ＬＴ↓［１］ＤＮＡ探 针；（２）将样本滤膜经ＲＮＡ酶Ａ和蛋白酶Ｋ消化处理后，进行核酸杂交，在适当条件下用地高辛素标记ＬＴ↓［１］ＤＮＡ探针检测产ＬＴ↓［１］的产毒性大肠杆菌。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹纬，彭文伟，谢彦博，
申请(专利权)人：中山医科大学第三附属医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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