一种用来检测病人样品内分析物的免疫测定法及其药盒制造技术

提供了改良的免疫检测方法和药盒，包括样品预处理方法和利用烷基化剂的药盒，该烷基化剂可修饰样品中的抗体使之不能干扰分析物检测。在进行免疫检测之前，失活烷基化剂以使其不修饰用于免疫检测中的抗体试剂。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测病人样品中分析物的存在或其量的改良的免疫检测法。具体地说，本专利技术涉及在改良的免疫检测方法中使用中性或碱性pH烷基化剂检测含有内源性抗体之样品中的分析物。过去二十年里，已发展了用于检测病人样品中是否存在特定分析物的免疫化学检测方法。在一种典型的免疫检测法中，用能够产生可检测信号的化合物标记检测试剂，并使该试剂与预期含有特定分析物的病人样品结合。被标记的检测试剂将以与样品中分析物的量相关的量结合于分析物上。已发现内源性抗分析物抗体和抗体与循环于血清样品中之分析物形成的免疫复合物可干扰分析物的免疫检测。美国专利4，703，001号描述了在免疫检测血清样品中酸稳定性分析物时解离免疫复合物和变性抗分析物抗体的预处理方法，该方法包括使血清样品在酸性pH下与pH依赖性离液序列高的离子接触。同样，P.Nishanian等人在J.Infect.Dis.162∶21-28(1990)中描述了一种用于解离分析物-抗HIV抗体免疫复合物和变性抗HIV抗体的酸水解血清样品预处理方法。但为了实现抗HIV抗体的完全变性，须用0.5N HCl溶液于37℃将试验血清处理60分钟。虽然如上所述用酸水解法处理蛋白质或肽抗原可提供准确的结果，但总是期望能更快地获得这些结果并有更高的敏感性。再者，某些分析物不能经受如此强烈的酸水解。例如，来自某些微生物脂多糖(LPS)抗原的2-酮-3-脱氧辛酮糖酸(KDO)糖将因如此处理而被水解，从而破坏了它们的抗原活性。因此，将期望有一种免疫检测方法，其中存在于病人样品中的内源性抗体可在大于7.0的pH且最好在碱性pH下不可逆地变性，但又不影响分析物的抗原性。预处理样品以修饰内源性抗体，进而减小或防止抗体对分析物检测的干扰，即可明显地改善分析病人样品中分析物之免疫检测法的效能。如上文所提到的，这些抗体和免疫复合物可干扰许多免疫检测法的分析物特异性结合步骤。本专利技术的样品预处理步骤利用了在大于7.0的pH，最好大于8.0的碱性pH下有活性的烷基化剂。本专利技术的烷基化剂在中性和碱性pH下有活性并且不影响分析物的抗原性。可望烷基化剂作用于抗体的赖氨酸、精氨酸或伯胺基团以修饰抗体上的这些基团，从而防止抗体干扰分析物检测，所说的烷基化剂包括但不限于戊二醛、邻位甲基异脲、甲醛、丁二酮、环已二酮和S-乙酰-巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺。在进行免疫检测之前，失活所说的烷基化剂，以使其不影响用于免疫检测的试剂。失活烷基化剂的方法根据所使用的烷基化剂而定。适用于本专利技术的一种类型的烷基化剂是在碱性pH下有活性而在中性pH下无活性的烷基化剂。这种类型的烷基化剂特别适用于以这样一种形式检测病人样品中存在的分析物，即需用某种碱性去污剂溶液预处理样品以提取分析物。在一个实施方案中，于免疫检测衣原体LPS，或相似的抗原之前，用碱性去污剂进行提取，然后用烷基化剂预处理样品。应在中和样品溶液之前加入烷基化剂。在一优选的实施方案中，于碱提取后加入只在碱性pH下有活性的烷基化剂，并与样品溶液保温足够长时间，使内源性抗体受到修饰，从而使之在免疫检测期间不能干扰对分析物的检测。必须选择适当的烷基化剂，以使其与用来提取分析物的其他试剂相容。保温后，经中和样品溶液而失活烷基化剂并完成免疫检测。在一个实施方案中，待检分析物是对酸敏感的。为本专利技术之目的，“酸敏感的”是指当在pH小于3.0的溶液中保温时分析物失去其抗原活性。为本申请之目的，酸敏感性分析物包括但不只限于源自砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和大肠杆菌(Escherichia coli)的具有KDO部分的的LPS抗原。在一特别优选的实施方案中，免疫检测LPS抗原并在抗原提取步骤后，合并加入烷基化剂和二硫赤藓糖醇(DTT)。DTT是一种粘液溶解剂及用于结合半胱氨酸的化学修饰剂。结合使用DTT和烷基化剂可提高信号的长时间稳定性并增加检测法的敏感性。本专利技术另一实施方案包括用于检测含干扰分析物检测之内源性抗体的病人样品中分析物的免疫检测药盒，该药盒包含对样品进行免疫检测以检测分析物的免疫检测试剂、能够在小于7.0的pH下使抗体上的基团烷基化从而防止内源性抗体干扰分析物检测的烷基化剂。该药盒进一步包含能够失活烷基化剂以使之不再修饰抗体的失活剂。在一个实施方案中，其中烷基化剂只在碱性pH有活性，且失活剂是中和剂。附图说明图1图解显示本专利技术的预处理方法对提取后分析物检测的影响。图2图解显示在没有使用本专利技术预处理方法情况下，提取后各不同时间对分析物检测的干扰。图3图解显示本专利技术的预处理方法在提取后不同时间对分析物检测的影响。图4显示Western印迹条纹，借以证明本专利技术的烷基化剂对病人样品内抗衣原体抗体结合分析物之能力的影响。本专利技术的试剂和方法可适用于检测以常规方法从眼、后鼻孔、子宫颈、阴道、尿道、直肠、咽喉、血液、血清、血浆、尿等材料中得到的病人样品。试剂和预处理方法可用于存在干扰分析物检测之内源性抗体的免疫检测法，但特别适用于在低pH下不稳定的分析物。可使用本专利技术的预处理方法提高许多不同的免疫检测法的效能。如放射免疫检测法、利用ELISA程序的免疫检测法和利用各种标记物如荧光和化学发光标记物的免疫检测法。一种这样的免疫检测法包括使提取的中和的样品溶液与抗固定于固相如微量滴定板孔、球、颗粒、管等上面之分析物的单克隆抗体接触，保温，加入以与分析物量相关的结合于固相上的标记的多克隆抗体，保温并检测标记物等步骤。用于特定免疫检测法的烷基化剂的量和浓度将依据样品类型即血清或尿生殖道拭子、其他免疫检测试剂的浓度、分析物的类型以及进行预处理的温度等因素而改变。在检测是否存在微生物的某些免疫检测法中，被检测的分析物是酸敏感性脂多糖(LPS)，如衣原体抗原。在检测这些衣原体抗原和相似抗原中，一般用包括碱金属或碱土金属离子的去污剂溶液预处理病人样品。在提取步骤中，部分变性或扰乱内源性抗分析物抗体。但在检测进行中，一旦样品溶液被中和，内源性抗体即复性并在免疫检测中干扰抗体试剂与分析物的结合，而使之不能识别分析物。虽然我们并不希望在理论上限制自己，但我们相信烷基化剂与已被部分变性或扰乱的抗体上的基团反应，而阻止抗体在免疫检测期间变性。一种类型的特别是用于免疫检测LPS的烷基化剂是只在碱性如大于8.0的pH条件下有活性的，而在中性或酸性pH条件下是无活性的烷基化剂。这种类型的烷基化剂包括但不只限于戊二醛、甲醛、邻位甲基异脲、丁二酮和环已二酮。因为在中性pH下进行典型的免疫检测时它们不会干扰检测法的效能，所以这些试剂是特别优选的。本专利技术的另一种类型的烷基化剂是在中性pH(pH7.0-8.0)有活性的，并且可因加入带有胺基团如Tris等叔胺或甘氨酸等伯胺的第二种试剂而失活。这种类型的烷基化剂包括但不只限于S-乙酰-巯基乙酸N-羟基琥珀酰亚胺。参见下列实施例将会更容易地了解本专利技术的方法，这些实施例是举例说明而不是限制本专利技术。实施例1-衣原体免疫检测法在完成预处理方法和免疫检测法中，使用Kallestad Pat本文档来自技高网...

【技术保护点】
用来检测含有干扰分析物检测之抗体的病人样品内分析物的改良的免疫检测法，所说的分析物是有抗原性的，该方法包括以下步骤：ａ）使样品与能够在小于７. ０的ｐＨ下使抗分析物抗体上的基团烷基化的烷基化剂接触，以修饰抗体使之不能干扰分析物检测，其中烷 基化剂是并不影响分析物之抗原性的试剂；ｂ）失活烷基化剂，并在其后ｃ）对样品进行免疫检测，以在被修饰的抗体存在下检测分析物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：JE琵特森，JW斯塔纷斯，
申请(专利权)人：比奥拉德巴斯德公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]