鉴定或分离分子的方法和由此鉴定的分子技术

与ＨＬＡ－Ａ２．１分子结合的分离的九肽，具有通式 Ｘａａ Ｌｅｕ Ｘａａ↓［７］， 其中第六个氨基酸残基是Ｓｅｒ，Ｌｙｓ或Ｐｈｅ，第九个氨基酸残基是Ｖａｌ或Ｉｌｅ。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鉴定所需分子的方法。在特别优选的实施方案中，本专利技术涉及鉴定与病变现象如癌(如黑素瘤或肾癌)，霍奇金病，自体免疫疾病等相关的分子。本专利技术还包括作为本专利技术的方法的结果发现的分离分子如提呈的肽。这些分子特别包括，含蛋白质的分子，编码它们的分离的核酸分子，和与含蛋白质的分子特异结合的抗体。为方便起见，将本文描述的方法称为“血清学钓取法”。背景和现有技术已经十分肯定的是许多病变现象如感染，癌，自我免疫紊乱等等其特征为某些分子的不适当的表达，所以这些分子可作为特殊病变或不正常现象的“标记”。除了它们作为诊断“靶”，即，待鉴定材料以便诊断这些不正常现象的作用，这些分子还可作为用于生产诊断剂和/或治疗剂的试剂。一个非限制性的例子是利用癌标记生产特异于特定标记的抗体。另一个非限制性的例子是利用与MHC分子复合的肽产生抗不正常细胞的胞溶性T细胞。当然，这些材料的制备以用于产生它们的试剂的来源为先决条件。离开某些这样做的方法，从细胞中纯化是费力的。另一个优选的方法是分离编码特定标记的核酸分子后利用分离的编码分子表达所需的分子。目前，已经利用两套计划检测在如人肿瘤中的这些抗原。这些方案被称为遗传途径和生化途径。如引入本文作为参考的DePlaen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA852275(1988)例举了遗传途径。在该途径中，将几百个从肿瘤得到的cDNA文库的质粒库转染进受体细胞如，COS细胞，或转染进测试特异抗原的表达的肿瘤细胞系的抗原阴性突变体。引入本文作为参考的Falk等，自然学351290(1991)，和Kawakami等，自然学36969(1994)例举的生化途径是根据在酸洗脱与肿瘤细胞的MHC-I分子结合的肽后进行反相高效液相色谱(R-HPLC)。在与缺失抗原加工能力和诱导胞溶性T-淋巴细胞的特异反应的突变细胞系的空MHC-I分子结合后，鉴定抗原性肽。这些反应包括在MTT测定方法或51Cr释放测定方法中可测量的CTL增殖，TNF释放，和靶细胞的溶解。对抗原的分子鉴定的这两套途径有下面的缺点首先，它们是非常麻烦，耗时和昂贵的；其次，它们依赖于建立具有预定特异性的胞溶性T细胞系(CTLs)；第三，由于不仅从患有有关疾病的病人，而且从健康的个体，依据它们的T细胞的全部组成，都可以得到有关的CTL，所以还没有证明体内它们与相关病理或疾病的发生的关系。至今，两种方法只成功地鉴定了人肿瘤中的极少数新抗原的事实最好地证实了抗原的鉴定和分子鉴定的两套已知途径内在的问题。参见如，van der Bruggen等，科学2541643-1647(1991)；Brichard等，实验医学杂志178489-495(1993)；Coulie等，实验医学杂志18035-42(1994)，Kawakami等，美国科学院院刊913515-3519(1994)。如人所愿的有效的方法是不仅能用于检测与肿瘤相关的抗原，而且能测定与任何不正常或病变现象相关的分子。这样的方法应简化这些分子的鉴定，从而使它们能用于如抗体，胞溶性T细胞等的生产。所以本专利技术的目的是开发简单检测和分子鉴定在人组织，特别是肿瘤细胞中的抗原的方法和试剂，这些方法和试剂可用于疾病的分子诊断和/或感染的和自体免疫的和恶性的疾病的免疫治疗和基因治疗。在下面的公开物中描述了本专利技术。附图的简要说明附图说明图1显示了本专利技术的途径的原理。图2显示了带有与1∶100稀释度的病人血清反应的来自肾细胞明显的癌的cDNA衍生的阳性克隆的硝酸纤维膜。图3显示了肾细胞癌，正常肾和其它人组织中的HOM-RCC-313克隆的Northern印迹分析图。图4显示了编码HOM-RCC-313的基因的翻译区。优选实施方案的详细说明下面的公开内容描述了称为血清学钓取法的方法。其中，从患有病变现象的个体中获取细胞样品。优选地，该细胞是病变的例子。例如，如果个体有黑素瘤，细胞是黑素瘤细胞。如果个体患了如神经紊乱，那么优选地细胞是患病细胞的样品。这条途径是有理由的，因为患病细胞最可能是所需的含蛋白质的分子，即，与所需的病变现象有特异关系的分子的最好来源。应该注意到代表病变现象的细胞不是可用于本专利技术的方法的唯一细胞。例如，非常重要的是，如，测定那些与细胞分化和成熟相关的细胞“标记”。可想到的例子是生血干细胞。同样，本专利技术涉及如特异配体的受体分子的分离。事实上，利用该方法可以测定任何所需分子的存在。然后将选择的细胞用于制备互补DNA(即，“cDNA”)文库。该方法是熟练技术人员所熟知的，不需要在这里重复说明。当然这是根据测定的事实即，如果细胞表达蛋白质，那么必须存在信使RNA(mRNA)。这些mRNA分子不能长时间存在，是不稳定的，所以利用它们操作是不可行的。利用cDNA时带给分子以稳定性对本方法是非常有帮助的。一旦制备了cDNA，就可用于构建载体文库。简要地说，处理载体，如切割和拼接，以使其接受cDNA分子。载体的选择可以变化，如熟练技术人员熟知的许多这样的例子。特别优选的是基于病毒的载体。在真核细胞中，基于逆转录病毒和腺病毒的载体是优选的。这样的载体含有所有或部分病毒基因组，如长末端重复(“LTRs”)，启动子(如，CMV启动子，SV40启动子，RSV启动子)，增强子等。当宿主细胞是原核细胞，则细菌病毒即噬菌体是优选的。这样的载体的例子有基于如λ噬菌体的载体。在任何情况下，载体可包括超过一个病毒的元件。将得到的载体转染或转化进宿主细胞，宿主细胞可以是真核的或原核的。在本方案中可以利用任何通常用于转染或转化的细胞。优选的材料包括大肠杆菌菌株，CHO细胞如CHO-1，COS细胞如COS-7等。同样，酵母细胞，如糖酵母属菌株，假单胞菌属菌株如绿脓杆菌，芽孢杆菌，已知的昆虫宿主细胞草地粘虫等都可以利用。一旦受体细胞接受载体，便培养它们，以便表达外源的含蛋白质的分子。本文使用“含蛋白质”是因为原核细胞只表达蛋白质，而众所周知真核细胞具有翻译后修饰蛋白质的能力以便产生如糖蛋白，脂蛋白。同时必须记住的是本文所用的“含蛋白质”也包括肽，如以MHC分子提呈的肽。下面描述的方法独立于上面描述的方法而发生，在本专利技术的这两个方面没有时间关系。在如癌和如自体免疫疾病的病变现象中，存在一些针对与病变相关的分子的免疫反应。这一反应可以包括抗体应答，B细胞增殖，特异T细胞亚群的增殖，细胞因子生产的增加等。在个体的体液如血清中，可以发现与应答相关的分子和细胞。不管所需分子是重组地或是自体产生，免疫效应器都将与其反应。问题在于发现它们，正如实施例显示，这以唯一的途径进行，首先，将体液或其它所需的样品与用于转染或转化的同样的宿主细胞样品反应，在这第一步中，宿主细胞没有被转染或转化，它的结果是去掉任何特异于宿主细胞而不是靶分子的免疫原性结合配体。这一步是必须的，因为正如上面指出的，宿主细胞可以是在一些点上个体已经发展了针对其的免疫应答的细胞，这首先的去杂(stripped)步骤除去了这些免疫成分。然后进行第二个去杂步骤。在这一步中，将前面去杂的样品与如上所述同样的宿主细胞的样品反应，这时宿主细胞已经用缺少来自个体的cDNA的载体转染或转化。这第二个去杂步骤的原因是本专利技术人之一所做的观察，在以前面的文献中没有报道。用作本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：米夏埃尔·普夫罗因德舒，汉斯格奥尔格·拉门赛，
申请(专利权)人：路德维格癌症研究所，
类型：发明
国别省市：