一种获得单细胞mRNA序列的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得单细胞mRNA序列的方法。本发明专利技术的方法：(1)利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，反转录得到具有细胞标签的cDNA；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；(2)利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；(3)高通量测序；(4)根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA的序列；根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列。本发明专利技术提供的方法可用于高通量获得大量单细胞中每个单细胞的所有mRNA的序列。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】一种获得单细胞mRNA序列的方法
本专利技术涉及一种获得单细胞mRNA序列的方法。
技术介绍
多细胞生物，顾名思义由多种细胞组成。在多细胞生物中，每种细胞类型均有自己独特的功能，这些具有不同功能的细胞聚合起来，共同构成了组织与器官，并最终作为一个整体定义了多细胞生命。每种细胞的谱系及其发育状态决定了它们与其他细胞，及其周边微环境的相互作用。不仅如此，即使分类在同一亚细胞类型中的不同细胞间也有极大可能存在遗传异质性。大部分单细胞测序的原初动力来自于癌症研究，因为癌症发生发展过程中不同细胞之间体现了高度遗传特异性，加之肿瘤样品取样存在一定困难，难免会有正常细胞混入其中，因此对单个细胞进行分别研究具有重要意义。但随着技术的发展，如今单细胞测序技术已经被广泛用于解析复杂生物学系统和过程，例如中央神经系统，免疫系统和哺乳动物发育过程。尽管目前在单细胞层面对组织和器官的生物学功能的了解仍然不甚清晰，但单细胞测序和相关分析技术仍提供了一窥未来的可能。除此以外，单细胞测序还为鉴定那些难于进行体外分离培养的细胞或生物提供了可靠手段。单细胞测序技术的发展改善了传染性疾病、食物传播以及具有抗药性的微生物病原体的检测准确性和灵敏度，同时为环境或肠道微生物多样性分析提供了解决方案。近年来高通量测序技术发展迅速，该技术以其高准确性和特异性成为了单细胞DNA/RNA测序的最佳选择。早年的单细胞技术依赖于显微操作或流式细胞仪，因此通量较低。近期出现的结合微流控平台和油包水技术方法将单细胞mRNA测序的检测细胞通量提升到了一个非常客观的数量级，但均无法对mRNA的全长进行测序，因此无法检测mRNA的可变剪切或基因融合，微流控芯片对于控制设备有一定要求，因此限制了该技术应用的进一步拓展。单细胞转录本测序最早起源于单细胞mRNA实时定量PCR(qPCR)检测技术，后者确定了转录本扩增的技术基础。之后随着高通量测序平台的不断发展，单细胞转录本测序技术也随之兴起。最早的单细胞分离方案依赖口吸管将单细胞从细胞群体中分离出来，对实验人员要求高，处理细胞通量低，但能够进行全长转录本的检测。后续又有研究人员开发出了基于激光显微切割的单细胞分离方法，需要昂贵设备支持，同时切割的细胞活性会受到一定程度损伤，影响下游实验结果。随后利用流式细胞术进行单细胞分选的方法也被开发出来，与激光显微切割方法类似，同样需要昂贵设备支持同时分选会对细胞活性有一定影响。之后Fluidigm公司推出了C1单细胞测序系统，该方法利用Fluidigm的微流控芯片将细胞捕获至特殊的小室中，从而实现单细胞分离的效果，Fluidigm C1系统价格较高(800美金/每次运行)，同时单细胞处理通量为96个细胞/每次运行，因此不具成本优势，Fluidigm计划升级该系统至384个细胞/每次运行、但相应成本也在增加。2015年出现了基于微流控/油包水液滴和带有细胞标签的载体的单细胞分离方法，极大提升了一次可以处理的单细胞数量，但由于载体上携带的细胞标签与进行逆转录oligo dT是绑定在一起的，因此在二代测序的短读长限制下，使用微流控/油包水液滴的方案进行单细胞mRNA测序只能检测mRNA的3‘端尾巴，无法对全长mRNA进行测序。专利技术公开本专利技术提供了一种获得单细胞mRNA序列的方法。本专利技术提供了一种获得单细胞mRNA序列的方法，包括如下步骤：(1)利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；(2)利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；(3)高通量测序；(4)测序结果根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA的序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列。本专利技术还提供了一种获得单细胞mRNA序列并定量的方法，包括如下步骤：(1)利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签和转录本标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签和转录本标签的固相载体；来自于同一细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；来自于同一细胞的各个cDNA具有不同的转录本标签；(2)利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；(3)高通量测序；(4)测序结果根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列；最后根据mRNA序列相同但转录本标签不同的序列数量，对每个单细胞的mRNA进行定量。本专利技术还提供了一种制备单细胞cDNA测序文库的方法，包括如下步骤：(1)获得具有细胞标签的cDNA；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；(2)获得具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签。获得具有细胞标签的cDNA的实现方法如下：利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体。获得具有分子标签的多个cDNA片段的实现方法如下：利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；分子标签载体为携带分子标签的固相载体。本专利技术还提供了一种制备单细胞定量cDNA测序文库的方法，包括如下步骤：(1)获得具有细胞标签和转录本标签的cDNA；来自于同一细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；来自于同一细胞的各个cDNA具有不同的转录本标签；(2)获得具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签。具体的，获得具有细胞标签和转录本标签的cDNA的实现方法如下：利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签和转录本标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签和转录本标签的固相载体。具体的，获得具有分子标签的多个cDNA片段的实现方法如下：利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；分子标签载体为携带分子标签的固相载体。具体的，在步骤(1)和步骤(2)之间可包括富集目标物的步骤。步骤(1)和步骤(2)之间的富集目标物的步骤，一种具体形式为PCR扩增，另一种具体形式为滚环扩增，也可为本领域技术人员所了解的其它方式。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得单细胞mRNA序列的方法，包括如下步骤：/n(1)利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；/n(2)利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；/n(3)高通量测序；/n(4)测序结果根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA的序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171228 CN PCT/CN2017/119342一种获得单细胞mRNA序列的方法，包括如下步骤：
(1)利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；
(2)利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；
(3)高通量测序；
(4)测序结果根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA的序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列。


如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签和mRNA捕获区。


如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子甲中具有分子标签和转座酶复合体捕获区。


如权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于：
在步骤(1)和步骤(2)之间包括富集目标物的步骤；
和/或
在步骤(2)和步骤(3)之间包括富集目标物的步骤。


如权利要求4所述的方法，其特征在于：
步骤(1)和步骤(2)之间的富集目标物的步骤，为PCR扩增或滚环扩增。


一种获得单细胞mRNA序列并定量的方法，包括如下步骤：
(1)利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签和转录本标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签和转录本标签的固相载体；来自于同一细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；来自于同一细胞的各个cDNA具有不同的转录本标签；
(2)利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签；分子标签载体为携带分子标签的固相载体；
(3)高通量测序；
(4)测序结果根据分子标签进行序列拼接，得到每个mRNA序列；进一步根据细胞标签，得到每个单细胞的所有mRNA的序列；最后根据mRNA序列相同但转录本标签不同的序列数量，对每个单细胞的mRNA进行定量。


如权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签、转录本标签和mRNA捕获区。


如权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子甲中具有分子标签和转座酶复合体捕获区。


如权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：
在步骤(1)和步骤(2)之间包括富集目标物的步骤；
和/或
在步骤(2)和步骤(3)之间包括富集目标物的步骤。


如权利要求9所述的方法，其特征在于：
步骤(1)和步骤(2)之间的富集目标物的步骤，为PCR扩增或滚环扩增。


一种制备单细胞cDNA测序文库的方法，包括如下步骤：
(1)获得具有细胞标签的cDNA；来自于同一个细胞的cDNA具有相同的细胞标签，来自于不同细胞的cDNA具有不同的细胞标签；
(2)获得具有分子标签的多个cDNA片段；来自于同一cDNA的各个片段具有相同的分子标签，来自于不同cDNA的片段具有不同的分子标签。


如权利要求11所述的方法，其特征在于：获得具有细胞标签的cDNA的实现方法如下：利用细胞标签载体捕获细胞的mRNA，然后进行反转录，得到具有细胞标签的cDNA；所述细胞标签载体为携带细胞标签的固相载体。


如权利要求11所述的方法，其特征在于：获得具有分子标签的多个cDNA片段的实现方法如下：利用转座酶复合体和分子标签载体，得到具有分子标签的多个cDNA片段；分子标签载体为携带分子标签的固相载体。


如权利要求12所述的方法，其特征在于：
所述细胞标签载体是将多条DNA分子乙连接至固相载体表面得到的；DNA分子乙为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子乙中具有细胞标签和mRNA捕获区。


如权利要求13所述的方法，其特征在于：
所述分子标签载体是将多条DNA分子甲连接至固相载体表面得到的；DNA分子甲为部分双链结构，由两条部分互补的单链DNA分子组成；所述DNA分子甲中具有分子标签和转座酶复合体捕获区。


如权利要求11或12或13或14或15所述的方法，其特征在于：
在步骤(1)和步骤(2)之间包括富集目标物的步骤。


如权利要求16所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：范飞，程小芳，章文蔚，汪为茂，崔路漫，王欧，
申请(专利权)人：深圳华大智造科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44