一种基于高通量测序的促生菌株筛选方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于高通量测序的促生菌株筛选方法及其应用。本发明专利技术通过构建有效的土壤功能筛选梯度，以便形成测试植物的生长和土壤微生物群落组成的梯度变化的差异，结合被广泛使用且价格低廉、准确率高的高通量测序技术分析土壤中微生物的群落组成，通过优势菌株OTU的绝对丰度和测试植株的生物量进行回归分析，判断优势菌株是否为潜在促生菌株，分离绝对丰度高的、优势的、潜在促生菌株，并进行回接试验验证其促生效果。该方法直接依赖于促生效果来筛选促生菌株，可以有效避免根据功能基因和功能选择培养基筛选的菌株在实际应用上的不确定性和假阳性；另外，该方法目标明确、成功率更高，在筛选促生菌株中的应用前景广泛。

【技术实现步骤摘要】
一种基于高通量测序的促生菌株筛选方法及其应用
本专利技术属于土壤微生物分离
更具体地，涉及一种基于高通量测序的促生菌株筛选方法及其应用。
技术介绍
土壤微生物数量庞大、种类繁多，是土壤中最为活跃和重要的部分，被称为地球关键元素生物地球化学循环过程的引擎。对植物而言，一些土壤微生物能够改善其营养状况、增强对逆境的耐受力、减少病虫害的发生并促进植株生长发育等。例如，菌根真菌。丛枝菌根真菌(arbuscularmycorrhizalfungi，AMF)作为一种分布极为广泛的土壤真菌，能与陆地上超过80％的植物根系建立互利互惠的共生关系。一旦建立共生关系后，AMF能够极大程度地改善宿主植物对多种矿质养分的吸收，特别是土壤中难移动磷元素。此外，AMF也被证实能显著提高宿主植物对干旱、盐胁迫、重金属、极端温度(高温和低温)、低pH、铝毒和有机污染物等的耐受力。除了真菌外，土壤中也存在一些能促进植物生长发育的细菌，它们被称为植物生长促进根际细菌(plantgrowthpromotingrhizobacteria，PGPR)。这些细菌具有产生植物激素、分泌铁载体、溶磷、降解有机污染物、抗旱和生物防控等能力，例如，伯克霍尔德氏菌(Burkholderiaphytofirmans)，荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)，寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)，淀粉液化芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)和鞘氨醇单胞菌(Sphingomonassp.Cra20)等。在农业中，充分挖掘和利用这类土壤微生物资源能够有效减少化肥和农药的使用，对农业的可持续发展和生态环境的保护有着巨大的应用潜力。随着测序技术的进步和测序成本的降低，被广泛使用的高通量测序(high-throughputsequencing)让人们认识到土壤微生物的生态多样性和功能多样性，这也极大地推动了人类对土壤微生物资源的挖掘和利用。现在科研上被应用最多的测序技术是二代测序，又被称为下一代测序技术(next-generationsequencingtechnology)。与三代测序相比，二代测序的技术更成熟、准确率更高、价格更便宜，而且测序长度也能满足微生物研究的需求。扩增子测序就是二代测序中微生物领域应用的最为广泛且成本更低的一种高通量测序技术，通过对真菌(18S或ITS)和细菌(16S)的rRNA基因高度变异片段的测序，能够有效识别微生物的物种信息。通常情况下，一些土壤微生物能被鉴定到菌株水平(operationaltaxonomicunit，OTU)。值得注意的是，虽然现有的测序技术能够鉴定微生物中是否携带一些促生特性的功能基因，但是这些功能基因能否在农业实际应用中充分发挥作用仍然是不确定的。到目前为止，与土壤微生物的促生作用相关的作用机制和功能基因并未完全被认识和挖掘。除此之外，通过功能选择的培养基筛选的高效菌株在实际应用中收效甚微的例子实属常见。这些问题源于人们对微生物的认识不够全面和深入，也没有充分考虑到应用环境对菌株的影响。这样的促生菌株筛选方式不够直接、有一定的盲目性和不确定性(姜云等，人参抗病、促生菌的筛选及田间效果评价，中国中药杂志，2018,43(11):2230-2235；LugtenbergandKamilova，Plant-growth-promotingrhizobacteria，2009,63:541-556)。此外，土壤微生物极易受到环境条件的影响，尤其是土壤理化性质。例如，土壤pH已经被证实是驱动土壤微生物群落的决定性因素之一。在陆地生态系统中胁迫条件也无处不在，而不利的环境条件不仅能够抑制土壤有益微生物的种群数量，也能够影响其功能，使得土壤微生物资源的利用潜力不能充分发挥。因此，从原始生境中直接挖掘优势且促生的菌株对于促生菌株的筛选具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有促生菌株筛选技术的缺陷和不足，提供一种基于高通量测序的促生菌株筛选方法及其应用。该方法直接依赖于促生效果来筛选促生菌株，可以有效避免根据功能基因和功能选择培养基筛选的菌株在实际应用上的不确定性和假阳性，对于未来促生菌株的筛选和绿色农业的发展具有重要意义。本专利技术的目的是提供一种基于高通量测序的促生菌株筛选方法。本专利技术另一目的是提供所述方法在筛选促生菌株中的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供了一种基于高通量测序的促生菌株筛选方法，包括以下步骤：S1.拟定促生菌株的土壤环境为原始生境土壤，构建土壤功能筛选梯度，原始生境土壤为其中的一个梯度；S2.在功能筛选梯度的土壤中种植测试植物，出现明显植株生长差异后取样并记录测试植物的生物量，植株取样后，收集根际土壤用于土壤微生物总DNA的提取和菌株分离；S3.提取土壤微生物总DNA后，扩增真菌和细菌的rRNA基因高度变异片段，建库和上机进行高通量测序；S4.对下机数据进行拼接、质控、过滤、去除嵌合体后，进行97％相似性聚类生成OTU和物种注释，去除非目标物种后，基于最小测序样本的序列数进行重抽样，即为下游分析使用数据；S5.使用优势菌株的绝对丰度和测试植株的生物量进行回归分析并计算回归方程y＝ax+b、P值和R2，其中，a为优势菌株的绝对丰度，y为测试植株的生物量，P值表示回归方程的显著性，R2表示决定系数；S6.根据步骤S5判断优势菌株是否为潜在促生菌株，结合潜在促生菌株的物种信息，通过分离菌株获得目标菌株，并进行回接试验验证其促生效果。本专利技术通过构建有效的土壤功能筛选梯度，以便形成测试植物的生长和土壤微生物群落组成的梯度变化的差异，结合被广泛使用且价格低廉、准确率高的高通量测序技术分析土壤中微生物的群落组成，通过优势菌株的绝对丰度和测试植株的生物量进行回归分析，判断优势菌株是否为潜在促生菌株，分离绝对丰度高的、优势的、潜在促生菌株，并进行回接试验验证其促生效果。优选地，步骤S6所述判断优势菌株是否为潜在促生菌株的方法为：当a为正数且P值＜0.05时，则判断优势菌株判断优势菌株。优选地，步骤S1所述梯度的类型包括土壤pH、土壤干旱程度、土壤盐胁迫程度或土壤重金属胁迫程度中的任意一种或几种。通过调节土壤pH(施用硫磺和氢氧化钙)、控制土壤含水量、在土壤中添加盐离子和重金属来构建土壤pH、土壤干旱程度、土壤盐胁迫程度或土壤重金属胁迫程度的土壤功能筛选梯度类型，以便形成测试植物的生长和土壤微生物群落组成的梯度变化的差异。优选地，步骤S1所述梯度的个数≥5个。优选地，步骤S6所述分离菌株时选择丰度高的潜在促生菌株。优选地，步骤S3所述高通量测序的方法为：根据目的菌株的类群选择对应的通用引物，扩增真菌的18S或ITS的rRNA基因高度变异片段，扩增细菌的16SrRNA基因高度变异片段，使用IlluminaMiseqPE300高通量测序平台，以3万个cleanreads测序深度进行高通量测序。优选地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于高通量测序的促生菌株筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：/nS1.拟定促生菌株的土壤环境为原始生境土壤，构建土壤功能筛选梯度，原始生境土壤为其中的一个梯度；/nS2.在功能筛选梯度的土壤中种植测试植物，出现明显植株生长差异后取样并记录测试植物的生物量，植株取样后，收集根际土壤用于土壤微生物总DNA的提取和菌株分离；/nS3.提取土壤微生物总DNA后，扩增真菌和细菌的rRNA基因高度变异片段，建库和上机进行高通量测序；/nS4.对下机数据进行拼接、质控、过滤、去除嵌合体后，进行97％相似性聚类生成OTU和物种注释，去除非目标物种后，基于最小测序样本的序列数进行重抽样，即为下游分析使用数据；/nS5.使用优势菌株的绝对丰度和测试植株的生物量进行回归分析并计算回归方程y＝ax+b、P值和R

【技术特征摘要】
1.一种基于高通量测序的促生菌株筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.拟定促生菌株的土壤环境为原始生境土壤，构建土壤功能筛选梯度，原始生境土壤为其中的一个梯度；
S2.在功能筛选梯度的土壤中种植测试植物，出现明显植株生长差异后取样并记录测试植物的生物量，植株取样后，收集根际土壤用于土壤微生物总DNA的提取和菌株分离；
S3.提取土壤微生物总DNA后，扩增真菌和细菌的rRNA基因高度变异片段，建库和上机进行高通量测序；
S4.对下机数据进行拼接、质控、过滤、去除嵌合体后，进行97％相似性聚类生成OTU和物种注释，去除非目标物种后，基于最小测序样本的序列数进行重抽样，即为下游分析使用数据；
S5.使用优势菌株的绝对丰度和测试植株的生物量进行回归分析并计算回归方程y＝ax+b、P值和R2，其中，a为优势菌株的绝对丰度，y为测试植株的生物量，P值表示回归方程的显著性，R2表示决定系数；
S6.根据步骤S5判断优势菌株是否为潜在促生菌株，结合潜在促生菌株的物种信息，通过分离菌株获得目标菌株，并进行回接试验验证其促生效果。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤S6所述判断优势菌株是否为潜在促生菌株的方法为：当a为正数且P值＜0.05时，则判断优势菌株判断优势菌株。


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【专利技术属性】
技术研发人员：姚青，冯曾威，刘晓迪，朱红惠，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44