一种基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法技术

一种基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法，属于生物技术领域。本发明专利技术的通过基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的研究方法切实可靠，严谨准确，成效显著，为CEF转分化形成的PGC‑like细胞介导产生的后代鸡的鉴定工作提供了一种新颖可行且高效的实验方法。

【技术实现步骤摘要】
一种基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法
本专利技术涉及一种通过基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法，属于生物

技术介绍
PGCs移植技术是通过生殖细胞保存实现物种恢复的有效途径，ChumaS等将小鼠的PGCs移植进出生后小鼠的睾丸中使移植的PGCs分化为了精原干细胞并得到了后代。鸟类上由于PGCs能够通过血液迁移的特点，TagamiT等将白来航鸡PGCs注射至受体后成功获得后代，成功复原了隐性白羽鸡，陆阳清等通过相同的方法在白来航鸡中成功实现东兰乌鸡和白来航鸡的PGCs移植，并产生纯种黑羽鸡。PGCs由于其生殖细胞的发育潜能，能够作为种质资源进行保护和利用，也可以作为基因编辑的目的细胞生产基因编辑动物。由于分离原代PGCs细胞数量少，且需以牺牲早期胚胎为代价，导致PGCs异种间移植应用并不广泛，禽类种质资源保护仍面临巨大难题。而有研究发现诱导多能性干细胞iPS可在特定条件下诱导成PGCs，将对个体无较大伤害，且能够在短期内大量获取的禽类体细胞重编程为iPS并进一步诱导成PGCs无疑是解决这一难题的最佳途径。本课题组前期已经建立了CEF诱导鸡iPS并进一步诱导分化为PGC-like细胞的转分化优化体系，同时也建立了原代PGCs迁移归巢模型并成功产生了后代。但CEF转分化形成的PGC-like细胞是否具有原代PGCs同样的产生后代的能力仍不清楚，且体外诱导的准确性仍不确定，因此，亟需对体外诱导转分化形成的PGC-like细胞介导产生的后代鸡进行基因组测序分析，研究通过体外诱导的PGCs产生后代的可行性和准确性，为实现PGCs在禽类资源保护过程中的广泛应用奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现有技术的不足，提供一种通过基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法。本专利技术的技术方案如下：本专利技术提供一种新型的通过基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法：前期将诱导转分化形成的狼山鸡PGC-like细胞注射至孵化2.5天的白羽受体鸡胚血管，封口后继续孵化至出壳，记录后代鸡的羽色、翅根颜色、胫色等表型性状，提取PGC-like细胞来源的后代鸡血液进行基因组测序，以正常的隐性白羽、狼山鸡作为对照，分析不同后代的来源。分析EGFP在后代鸡中的插入情况，同时分析后代中具有相似表型的个体基因组中的SNP分布的异同和基因组随机插入位点的异同。结果发现能够明确鉴定阳性后代的来源于狼山鸡CEF诱导转分化形成的PGC-like。本专利技术的通过基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的研究方法切实可靠，严谨准确，成效显著，为CEF转分化形成的PGC-like细胞介导产生的后代鸡的鉴定工作提供了一种新颖可行且高效的实验方法。本专利技术的有益效果如下：本专利技术严谨准确，切实可行，应用广泛。PGCs由于其生殖细胞的发育潜能，能够作为种质资源进行保护和利用，也可以作为基因编辑的目的细胞生产基因编辑动物，通过禽类体细胞重编程为iPS并进一步诱导成的PGC-like细胞异体/异种间移植产生后代，突破了分离原代PGCs细胞数量少且须牺牲早期胚胎的障碍。而对PGC-like细胞介导产生的后代鸡进行基因组测序分析，对研究体外诱导的PGCs介导后代鸡生产的可行性和准确性具有重大意义。此外，鸡是非哺乳动物中研究遗传学最重要的模式生物之一。因此本专利技术的实验方法不仅在家禽上种质资源保护过程中可行，在脊椎动物的其他研究领域也可应用。这一专利技术将基因组测序和PGCs来源的后代鸡的鉴定联系在一起，将为CEF转分化形成的PGC-like细胞介导后代鸡的生产研究提供更多的理论基础和技术支撑，也有利于对禽类种质资源进行保护和利用，同时也有利于转基因鸡的生产研究。具体实施方式诱导转分化形成的PGC-like细胞移植产生后代将诱导转分化形成的狼山鸡PGC-like细胞注射至孵化2.5天的白羽受体鸡胚血管，封口后继续孵化至出壳，记录出壳时后代鸡表型，育雏期间观察后代鸡羽色等表型变化，每周对后代鸡进行称重，饲养至1月龄时进行采血，进行基因组测序。证明父母代的印迹在后代同时出现①对现有的狼山鸡群和隐性白羽鸡群进行翅静脉采血，提取基因组DNA，基因组测序由广州基迪奥生物公司负责完成。在GenBank数据库中筛选合适的SSR，并通过毛细血管测序（Sanger测序）证明双亲SSR在后代中出现种系传递。②设计微卫星指纹的特异性引物，对现有的狼山鸡群和隐性白羽鸡群基因组DNA进行扩增，由擎科生物公司进行微卫星检测。羽色相似后代间的相关性分析对后代鸡中的羽色相似的个体进行翅静脉采血，提取基因组DNA进行测序，通过测序数据分析毛色相似的个体之间的亲缘关系。不同羽色个体间羽色相关基因的变异分析通过基因组测序，系统筛选羽色相关基因黑色素皮质受体1（MelanocortinReceptor1，MC1R）、酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）、“刺鼠相关蛋白（Agouti-relatedprotein，AGRP）等的变异，通过测序数据分析不同羽色的个体之间的亲缘关系，分析是否是因为基因分离或是慢病毒载体的插入导致不同羽色性状的出现。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法，其特征是，前期将诱导转分化形成的狼山鸡PGC-like细胞注射至孵化2.5天的白羽受体鸡胚血管，封口后继续孵化至出壳，记录后代鸡的表型性状，提取PGC-like细胞来源的后代鸡血液进行基因组测序；以正常的隐性白羽、狼山鸡作为对照，分析不同后代的来源；分析EGFP在后代鸡中的插入情况，同时分析后代中具有相似表型的个体基因组中的SNP分布的异同和基因组随机插入位点的异同；结果发现能够明确鉴定阳性后代的来源于狼山鸡CEF诱导转分化形成的PGC-like。/n

【技术特征摘要】
1.一种基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法，其特征是，前期将诱导转分化形成的狼山鸡PGC-like细胞注射至孵化2.5天的白羽受体鸡胚血管，封口后继续孵化至出壳，记录后代鸡的表型性状，提取PGC-like细胞来源的后代鸡血液进行基因组测序；以正常的隐性白羽、狼山鸡作为对照，分析不同后代的来源；分析EGFP在后代鸡中的插入情况，同时分析后代中具有相似表型的个体基因组中的SNP分布的异同和基因组随机插入位点的异同；结果发现能够明确鉴定阳性后代的来源于狼山鸡CEF诱导转分化形成的PGC-like。


2.根据权利要求1所述的一种基因组测序鉴定PGCs介导后代生成的方法，其特征是，具体包括如下步骤：
1）CEF诱导转分化形成的PGC-like细胞移植产生后代；
2）证明父母代的印迹在后代同时出现；
3）羽色相似后代间的相关性分析；
4）不同羽色个体间羽色相关基因的变异分析。


3.根据权利要求2所述的一种基...

【专利技术属性】
技术研发人员：李碧春，袁霞，左其生，姜景译，丁颖，石祥，张明，张亚妮，孙红艳，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32