检测血液中幽门螺杆菌抗原的方法技术

本发明专利技术涉及在被感染个体的血液中发现和检测幽门螺杆菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）抗原。此幽门螺杆菌抗原是幽门螺杆菌细胞的组分，其包括但不限于ＤＮＡ，ＲＮＡ，核苷酸、蛋白和肽片段。幽门螺杆菌ＤＮＡ、ＲＮＡ及核苷酸片段抗原通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）、连接酶链反应（ＬＣＲ）或ＤＮＡ杂交方法或其它扩增方法检测。幽门螺杆菌蛋白或肽或其它抗原组分可通过免疫检定或免疫印迹法用幽门螺杆菌抗体检测，该抗体优选是通过亲和柱纯化的抗体。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在血液(包括全血、血浆及血清)中对幽门螺杆菌(H.pylori)抗原及其抗原片段的发现。发现于血液中的幽门螺杆菌抗原包括但不限于幽门螺杆菌DNA、RNA或其片段、或者幽门螺杆菌蛋白/肽或其其它抗原组分。幽门螺杆菌DNA或其片段由聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、DNA杂交、分支DNA信号放大检测或其它信号放大方法进行检测。其幽门螺杆菌RNA由PCR、杂交或其它信号放大检测方法检测。幽门螺杆菌蛋白或肽或其其它抗原组分由免疫检测或免疫印迹实验用对幽门螺杆菌的亲和纯化抗体来检测。本专利技术还涉及通过检测血液中的幽门螺杆菌抗原来诊断幽门螺杆菌感染。幽门螺杆菌(H.pylori)是革兰氏阴性细菌，其侵染胃粘膜并且是多数消化性溃疡病(PUD)的诱因。至今为止，溃疡及其它形式的消化不良被认为与应激反应水平或饮食习惯有关。最近，医学界已确认幽门螺杆菌是某些形式的胃疾病包括溃疡和胃癌的诱发剂。根除幽门螺杆菌促进了溃疡的愈合并大大降低了癌症和PUD的发病率。幽门螺杆菌引起大部分胃和十二指肠溃疡以及消化性溃疡病(PUD)。幽门螺杆菌和PUD的联系最先由澳大利亚医生Warren和Marshall于1984年发现(LancetI1311-1344)。现在，幽门螺杆菌感染被看作是胃炎的最常见病因，且从病因学角度讲，其与胃溃疡、十二指肠溃疡、胃腺癌和原发B细胞淋巴瘤有关。现已证实，PUD是可治愈的，且相当容易。多数PUD的病因是幽门螺杆菌感染。但是，幽门螺杆菌感染不能常规诊断，这可能是因为检测幽门螺杆菌的方法(即侵入性活组织检查)不能使医生特别是主治医师满意。因此，主治医师倾向于用抗分泌剂来治疗病发的患者。医生需要一种简单、准确且廉价的诊断幽门螺杆菌感染的方法，以便使他们知道何时治疗病人以及何时将病人引见给胃肠病学家。但是，目前的幽门螺杆菌检测，可以归类为侵入性检查和非侵入性检查，它们都不能令人十分满意。侵入性检查需要先使用内窥镜然后进行活组织检查。对由活组织检查方法获得的组织样本，再通过培养、组织学或快速尿素酶实验进行分析。虽然对活组织检查样本的培养为幽门螺杆菌检验提供了最可靠的结果，但是在较好的实验室中报告的成功率仅在70％至80％之间(Han，S.W.等，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.(1995)，14349-352)。对特殊染色的活组织检查样本的检查可以为急性或慢性炎性粘膜细胞和损伤提供直接的证据。但是，这需要内窥镜医生和病理医生的合作(Genta，R.M.等，Hum.Pathol.(1994)，25221-226)。快速脲酶检验检测由幽门螺杆菌脲酶产生的氨引起的pH升高，该脲酶将脲分解为氨和二氧化碳。但是，其需要高密度的细菌，且降低该细茵量的任何事件都会造成假阴性结果(Cutler，A.F，Am.J.Med.(1996)，10035S-39S)。自1990年以来，已开发了一些非侵入性检验方法来检查幽门螺杆菌感染的存在。例如，尿素呼吸实验是基于此生物体的脲酶活性，该脲酶将用13C或14C标记的脲分解为非放射性13CO2或放射性14CO2。此脲呼吸实验被广泛推荐用来证实在治疗4周后对幽门螺杆菌的根除。美国专利5,716,791、5,871,942和5,932,430公开了用多克隆抗体检测粪便样本中幽门螺杆菌抗原的免疫检测方法，其中多克隆抗体得自用幽门螺杆菌细胞(即ATCC株43504)致敏的动物。此抗体通过DEAE(二乙基氨基乙基纤维素)柱纯化。虽然此粪便抗原检验据报告是令人满意的，但是发现粪便样本的收集和处理是困难且令人不快的。很多患者不愿意给医生提供粪便样本，是由于令人不快的气味和缺乏方便的收集器具。用ELISA对血清幽门螺杆菌抗体进行血清检验是另一种广泛使用的实验。最新技术的实例见美国专利5262156和EP 0329570。已鉴定了几种主要的抗原并用于检查幽门螺杆菌抗体的免疫检测方法中。但是，这些检测方法不具血清诊断要求的特异性和灵敏性(Newell，D.G.等，Serodian.Immunother.Infec.Dis.，(1989)，31-6)。问题之一是由交叉反应造成的。这是由于幽门螺杆菌中的显性抗原(例如，分子量为60Da的假设的鞭毛蛋白)对幽门螺杆菌来说不是特异性的。一些这样的抗原发现于其它细菌如C.jeuni和C.coli。在设计幽门螺杆菌免疫检测中遇到的第二个问题是株变异。在幽门螺杆菌的不同株中已观察到了抗原的实质不同。这些问题妨碍了用单一抗原设计检测方法。对幽门螺杆茵抗体检测的特异性和灵敏性已进行了改进，即使用得自不同幽门螺杆菌株的抗原混合物，该混合物富含某些抗原片段。一种检测血清中幽门螺杆菌抗体的ELISA试剂已市售。此检测使用细菌的全细胞裂解物作为抗原。使用以抗原检测血清中幽门螺杆菌抗体存在的ELISA还有其它缺点。具体地讲，在感染已经治疗后的较长时间内(一些情况中长达12个月)人血清中此抗体滴度仍保持高水平。于是，用此ELISA得到的阳性结果并不一定说明该患者目前被感染并需要对幽门螺杆菌感染进行治疗。当面对阳性ELISA时，在开始抗生素治疗前，治疗医生常要求胃活组织检查以证实该细茵的存在。因此，基于抗原的ELISA不能排除对侵入性方法的需要。因此，本专利技术的目的是设计对幽门螺杆菌感染的非侵入性的和高准确度的诊断方法。在研究期间，发现了血液中的幽门螺杆菌抗原，它们是以DNA或其片段，或蛋白/肽或其其它抗原组分的形式存在于血液(包括全血、血浆和血清)中。因此，设计了检测这些幽门螺杆菌抗原的特殊方法，以提供幽门螺杆菌抗原片段存在于血液中的证据。这些方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)和DNA杂交，用得自幽门螺杆菌菌株的、对幽门螺杆菌具特异性的引物或寡核苷酸及/或DNA探针，来检测幽门螺杆菌的核酸片段。此外，还开发了免疫检测和免疫印迹实验，用针对幽门螺杆菌的亲和纯化抗体来检测幽门螺杆菌的蛋白/肽或任何抗原组分。目前，尚没有关于血液中存在幽门螺杆菌抗原的报道。本专利技术第一个证明了幽门螺杆菌抗原不仅存在于血液中，并且还可以通过下面部分给出的方法检测。本专利技术提供了存在于患者血液中的幽门螺杆菌抗原，并可以提供聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、DNA杂交、RNA杂交、分支DNA检测、免疫印迹及免疫检测方法进行检测。本专利技术还提供了通过检测血液中的幽门螺杆菌抗原来诊断幽门螺杆菌感染的方法。本专利技术中使用的术语“抗原”广义地包括了在适当条件下能直接或间接引起特异性免疫反应且与该反应的产物反应(即与特异性抗体或特异性致敏的T淋巴细胞反应，或二者兼而有之)的任何物质。这些物质的实例包括但不限于蛋白/肽、多糖、脂类和多或寡核苷酸。在血液中可以检测的幽门螺杆菌抗原具有特定的两种类型。第一类涉及多核苷酸或寡核苷酸，它们是幽门螺杆菌的染色体DNA、RNA或其片段。此类幽门螺杆菌可以通过聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)及杂交(优选点状DNA杂交)方法或其它扩增方法检测。本专利技术的PCR方法需要使用特异性检测幽门螺杆菌的一对引物。本文中术语“引物”指寡核苷酸，不论是天然的还是合成的，当置于引起与核苷酸链互补的引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
血液中的幽门螺杆菌抗原，其是通过聚合酶链反应，用一对特异性检测幽门螺杆菌的引物检测的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：伊庆燧，
申请(专利权)人：苏荣仁，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]