一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的甲基化检测试剂在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或用于预测受试者是否具有患结直肠癌风险或用于判断结直肠癌预后的试剂盒中的应用，属于生物检测技术领域。本发明专利技术通过联合检测LRRC3B、PENK和RASSF1三个抑癌基因的启动子甲基化程度，能够实现对结直肠癌进行预防、早期诊断、临床治疗及预后评价。

【技术实现步骤摘要】
一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用
本专利技术涉及生物检测
，具体地，涉及一种抑癌基因甲基化联合检测试剂盒及其应用。
技术介绍
我国结直肠癌(colorectalcarcinoma，CRC)发病率居第3位，占癌症死因第4位。结直肠癌是一种可以预防、早诊早治的恶性肿瘤，“三早”(早期发现，早期诊断，早期治疗)是提高结直肠癌治疗效果的最有效方法。临床资料显示：早期癌症病人术后5年存活率高达90％以上。然而，由于结直肠癌早期无特异性临床表现且缺乏高灵敏度和特异性的早期诊断技术，大部分患者确诊时已是癌症晚期，失去了最佳治疗时机，导致术后5年存活率很低(低于20％)。肿瘤早期诊断通常取决于两个关键因素：检查指标的高度特异敏感和检测方法的无创易行。粪便隐血检测(faecaloccultbloodtesting，FOBT)是当前大肠癌筛查最为广泛的方法，为大肠癌的发现提供了重要诊断价值。但FOBT受饮食和药物影响大，特异性差，不可区分息肉和癌。钡剂灌肠气钡双重造影(doublecontrastbariumenema，DCBE)等影像学检查简便易行，痛苦少，但不能评估大肠癌的浸润深度及外侵范围。电子结肠镜检查(colonoscopy，CS)是大肠癌诊断的金标准，能对犯病的部位切除和活检，但属于侵入性操作，不适宜早期筛查。而现行结直肠癌经典筛查应用的肿瘤标志物如CEA、CA199特异性及敏感性较差。因此，寻找及开发出经济简便、高灵敏度特异度的生物标志物进行结直肠癌的早期筛查和诊断，意义重大。
技术实现思路
为了于克服现有技术中的缺陷，专利技术人前期研究发现，LRRC3B、PENK和RASSF1在多数正常组织中高表达，但在结直肠癌患者中异常低表达，并且与肿瘤分期呈现负相关。进一步研究表明血清游离LRRC3B、PENK和RASSF1三个抑癌基因的启动子的甲基化水平可预测结直肠癌的发病。从而完成本专利技术。本专利技术第一方面提供选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的甲基化检测试剂在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或用于预测受试者是否具有患结直肠癌风险或用于判断结直肠癌预后的试剂盒中的应用。在本专利技术的一些实施方案中，所述甲基化检测试剂用于检测所述基因的启动子甲基化状态。在本专利技术的一些具体实施方案中，所述甲基化检测试剂包括用于检测所述基因启动子甲基化状态的特异性引物。在本专利技术的一些优选实施方案中，用于检测LRRC3B基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的下游引物；用于检测LRRC3B基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的下游引物。在本专利技术的一些优选实施方案中，用于检测PENK基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的下游引物；用于检测PENK基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.8所示核苷酸序列的下游引物。在本专利技术的一些优选实施方案中，用于检测RASSF1基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.10所示核苷酸序列的下游引物；用于检测RASSF1基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.11所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.12所示核苷酸序列的下游引物。在本专利技术的一些实施方案中，所述甲基化检测试剂进一步包括用于提取样本DNA的试剂。在本专利技术中，所述所述样本为全血或血浆，所述DNA为血浆游离DNA。本专利技术的第二方面提供选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的启动子甲基化检测试剂在制备适用于以下方法的试剂盒中的应用，所述方法包括：S1，提取受试者样本DNA，S2，利用所述检测试剂检测所述基因的启动子甲基化状态，S3，根据S2检测得到的甲基化状态，诊断受试者是否患有结直肠癌或预测受试者是否具有患结直肠癌风险或判断结直肠癌预后情况。在本专利技术的一些实施方案中，当受试者LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因甲基化水平高于正常水平时，诊断受试者患有结直肠癌，或预测受试者具有患结直肠癌风险，或判断结直肠癌预后不良。本专利技术的第三方面提供一种用于诊断受试者是否患有结直肠癌或用于预测受试者是否具有患结直肠癌风险或用于判断结直肠癌预后的试剂盒，包括选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的启动子甲基化状态检测试剂，其中，用于检测LRRC3B基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的下游引物；用于检测LRRC3B基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的下游引物。用于检测PENK基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的下游引物；用于检测PENK基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.8所示核苷酸序列的下游引物。用于检测RASSF1基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.10所示核苷酸序列的下游引物；用于检测RASSF1基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.11所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.12所示核苷酸序列的下游引物。本专利技术的有益效果本专利技术相对现有技术，具有以下有益效果：联合检测LRRC3B、PENK和RASSF1可以作为结直肠癌早筛、诊断、疗效评价、预后判断的生物标志物，以其为基础的联合检测试剂盒，可用于结直肠癌的早期筛查、诊断、疗效监测及预后评价。本专利技术的检测方法方便快捷、价格低廉，适于推广应用。本专利技术采用血浆游离DNA进行检测，与经典的肿瘤标志物相比，ctDNA具有更高的准确性和特异性，是一种无创、临床应用前景广泛的新型肿瘤标志物，可定性、定量、跟踪肿瘤的消失、扩散和复发。另外，DNA甲基化是肿瘤发生中较频繁的早期事件，作为肿瘤早期诊断和筛查具有RNA、蛋白及基因突变不能比的优势：1)DNA样本极其稳定，不似RNA及蛋白，受环境影响大；2)甲基化特异PCR(MSP)的敏感性、方法操作简单，不需要昂贵的仪器设备，比定量检测方法更可行(临床样品中不可避免地存在源于正常细胞的序列会严重干扰肿瘤细胞特征性的遗传学生物标志的检出，造成定量检测方法早期诊断肿瘤的障碍；探讨筛选的抑癌基因甲基化在乳腺癌发生发展中的作用，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的甲基化检测试剂在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或用于预测受试者是否具有患结直肠癌风险或用于判断结直肠癌预后的试剂盒中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.选自LRRC3B、PENK和RASSF1基因中的至少一个基因的甲基化检测试剂在制备用于诊断受试者是否患有结直肠癌或用于预测受试者是否具有患结直肠癌风险或用于判断结直肠癌预后的试剂盒中的应用。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述甲基化检测试剂用于检测所述基因的启动子甲基化状态。


3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述甲基化检测试剂包括用于检测所述基因启动子甲基化状态的特异性引物。


4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于检测LRRC3B基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.1所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.2所示核苷酸序列的下游引物；用于检测LRRC3B基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.3所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.4所示核苷酸序列的下游引物。


5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于检测PENK基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.5所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.6所示核苷酸序列的下游引物；用于检测PENK基因启动子非甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.7所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.8所示核苷酸序列的下游引物。


6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，用于检测RASSF1基因启动子甲基化状态的特异性引物包括具有SEQIDNO.9所示核苷酸序列的上游引物和具有SEQIDNO.10所示核苷酸序列的下游引物；用于检测RASSF1基因启动子非甲基化状态的特...

【专利技术属性】
技术研发人员：向廷秀，彭溦雁，唐俊，邱祝，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属第一医院，
类型：发明
国别省市：重庆;50