本发明专利技术涉及标记组分、荧光探针、寡核苷酸、杂交试样和使用这些产品的免疫测定以及制备这些产品的方法。本发明专利技术提供了一种可检测的已标记的标记组分，该组分含偶联到两个或更多小的增溶轴向配体上的荧光团部分，［定义］优选这种组分可减少或消除溶剂敏感性和非特定结合的问题。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
介绍本专利技术主要涉及。优选的染料包括连接到两个或更多增溶配体上的发光的基本上为平面的荧光团。相关申请本申请要求Dandliker等于1998年11月25日申请的、标题为“”的美国临时申请60/109,969的在先权益，在此将其完整地(包括附图)结合到本文中作为参考。本专利技术背景将本文涉及的出版物和其他参考资料结合到本文中作为参考。以下对本专利技术背景的描述是为了帮助理解本专利技术，并不是对本专利技术的特征的描述或是以先有技术来构成本专利技术。卟啉(porphyins)、酞菁和其他氮杂卟啉(azaporphyrin)和某些其他含氮的芳族大环化合物的近红外线吸收和发射有时使这些化合物作为用作荧光标记的具有吸引力的选择物。酞菁，特别是由于它们较强的近红外线吸收(摩尔消光系数约200,000)、它们在有机溶剂中的高量子产额和众所周知的抵抗普通金属酞菁染料褪色的能力，使人们在利用它们作为荧光标记方面作出了许多尝试。但是，沿着这条思路的早期的尝试没有得到完全令人满意的产品，很大原因在于酞菁的非同寻常的强缔合趋势，特别是以面对面聚集体的方式进行堆积以及还很强地结合于各种其他分子表面(非特定结合(non-specific binding))。分子内堆积的结果使未取代的酞菁在有机和水溶剂中都有极低的溶解度。正如现在所熟知的，堆积的趋势可以通过引入一种或多种带电基团(如磺酸根)得到显著降低。而具有这种取代的酞菁可以在水和电解质的水溶液中具有高溶解度，基本上保留了其非特定结合的趋势。目前，大多数关于荧光标记的科学研究集中在涉及生物材料的应用领域，其中所述生物材料如组织切片、细胞、细胞碎片、蛋白质，包括糖蛋白和脂蛋白、肽寡-和多-糖，寡-和多-核苷酸和类脂。在涉及这些材料的荧光测定中的非特定结合的趋势可以通过部分掩蔽有关的特定相互作用来干扰。非特定结合与堆积的趋势都可以通过将酞菁染料与一种或多种聚氧化烃基基团(polyoxyhydrocarbyl groups一般为甲氧基封端的聚(乙二醇)(PEG))偶联，将其减少到在治疗药物检测中可忽略的水平。同时，这种基团的附着保留了所需的吸收和发射特性。这种技术对于大量其他近红外线染料同样有效。参看Dandliker等人于1995年6月7日申请、标题为“用于荧光检测的聚氧化烃基相关产品和方法”的美国专利申请第08/476,544号，Lyon & Lyon Docket 211/167号(以及其中所指的在先申请)，将其完整地结合到本文作为参考，包括所有附图。最近，在可发荧光的染料方面有了显著的发展。一方面，目前能够得到通过更长波长(如红光和红外光波长)的辐射激发的染料。这些染料在下述两个共同转让的专利申请中有描述。Arrhenius于1991年5月15日申请、标题为“荧光标记组分和荧光探针”的美国专利申请系列701,449号(这是1990年5月15日申请的美国专利申请523,601号的连续部分)，Dandliker和Hsu于1991年5月15日申请、标题为“无聚集和血清结合的荧光染料”的美国专利申请系列701,465号(这是1990年5月15日申请的美国专利申请系列524,212号的连续部分)。将这些申请完整地结合到本文作为参考，包括所有附图。通过数据收集和分析技术在提高灵敏度方面有了更加显著的改进。如Dandliker等在标题为“荧光计”的美国专利第4,877,965号中所述(将其完整地结合到本文作为参考，包括所有附图)，将数据收集和分析技术与时间门控技术(time gating techniques)结合使用得到相对于背景改进的信号。通常，4,877,965号专利认为检测强度作为时间的函数，由来自不同来源的信号组成，包括所需的信号源和各种不需要的背景源。通过数据收集和分析技术能够实现所需信号的最佳化。在免疫测定中对检测相关物质的能力方面也取得了显著的改进。例如，使用Dandliker等于1990年3月6日申请、标题为“过渡态(transient state)荧光测定”的美国专利申请系列490,770号(这是1989年6月13日申请的美国专利申请系列365,420号的继续部分)中所描述的技术，能够在均相测定中检测到物质的结合和游离形式，该专利被完整地结合到本文作为参考，包括所有的附图。通常，该技术要求对平行和垂直极化组分的强度随时间的衰变进行测量。通过测量不同极化状态的时间相关的衰变，在均相分析形式下能够确定物质(如半抗原、肽或小的蛋白质)的结合和游离形式。重要的是，这种技术不要求对结合和游离物质进行分离。尽管在可发荧光的染料领域和在数据分析方面有了显著和大有希望的改进，在该
仍旧需要具有这些和/或其他优势的另外的染料，并且这种染料也具有有利的化学反应性。本专利技术概述本专利技术开发出了一种意想不到的结果即使是非常小的基团，如-OH，如果在平面分子上存在两个这样的基团，其中的一个在分子平面的任一面上，也能有效地阻止分子发生非特定结合和堆积。通过提高净负电荷增强了这些配体对许多生物体系的有利效果，这些生物体系中大多数“生物分子”自身携带有负的净电荷。因此，本专利技术的一个方面在于只要染料上的净电荷足够大，通过用两个极小的轴向配体(axial ligands)(如-OH)代替将工程酞菁和其他荧光染料偶联到聚氧化烃基基团上，能够实现所需的效果。在大多数情况下，优选这种净电荷为负的，这是由于在生理学的pH范围内大多数生物物质包括蛋白质和DNA也会携带负的净电荷。因此，我们发现高度磺化的二羟基-硅-二羧基-酞菁具有几乎与PEG共扼的未磺化的染料同样低的对血清蛋白质的非特定结合。此外，本专利技术的一个优势表现在不存在由PEG形成的分子团。PEG工程染料在染料浓度为10-4M和以上时，其表现非常类似于大分子，因此当其通过设计为防止约30K道尔顿或更高的分子通过的膜时受到了极大的阻碍。而且，在设计用来从小分子中分离大分子的凝胶渗透色谱法中，染料在色谱的空隙容积中移动。相反，经磺化的二羟基-二羧基-硅-酞菁(SDDSiPc)的表现正如对具有这种式量的分子所预期的那样。至于通过改变荧光极化和强度所测得的非特定结合，当这些染料暴露于例如稀释的人体血清时，SDDSiPc的表现与PEG偶联染料(参见实施例6)大体相同。在这方面，鉴于未磺化的二羟基-二羧基-硅-酞菁(DDSiPc)表现出明显的非特定结合，很重要的一点是注意其本身的负电荷在降低非特定结合方面具有显著作用。羟基-铝-酞菁-三磺酸盐表现出对离子强度很强的敏感性，也具有很强的非特定结合。看来酞菁分子必须在其分子平面的两面上都具有轴向配体，但如果净电荷足够高时，-OH基团的是也要足够大以事实上消除非特定结合。本专利技术的另一个优点在于即使被标记的分子(如蛋白质和寡核苷酸)自身带有负电荷，用-OH或其他小的增溶轴向配体与高电荷一起改造的染料似乎更具有化学活性(在标记反应中)。这表明尽管通常易于对半抗原和其他小分子进行标记，但PEG配体确实干扰了对分子的标记。由于羟基-铝-酞菁-三磺酸盐具有很强的非特定结合，从这一点人们可推测带有较小负净电荷的二羟基-二羧基-硅-酞菁将会表现出比铝染料更强的非特定结合，因此本专利技术是非常出乎意料的。本专利技术的一部分正是基于这些表现出本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可检测的已标记的标记组分，所述标记组分包含发光的基本上为平面的荧光团部分，所述荧光团部分偶联到两个或更多小的增溶轴向配体（ａｘｉａｌ ｌｉｇａｎｄ）上，其中一个轴向配体位于所述荧光团部分的任一侧。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：WB丹德里克，ML许，
申请(专利权)人：海珀里昂有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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