可使甘油脱水的新型酶制造技术

本发明专利技术涉及生产１，３－丙二醇的改进的方法和试剂。更具体而言，本发明专利技术提供能催化甘油发酵为１，３－丙二醇的新型嗜热生物和热稳定酶。本发明专利技术也涉及分离这些嗜热生物的方法，克隆编码这些酶的多核苷酸的方法，编码这些酶的多核苷酸，和利用这些酶和生物生产１，３－丙二醇的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
1 专利
本专利技术涉及生产1，3-丙二醇的改进的方法和试剂。更具体而言，本专利技术提供能催化甘油发酵为1，3-丙二醇的新型嗜热生物和热稳定酶。本专利技术也涉及分离这些嗜热生物的方法，克隆编码这些酶的多核苷酸的方法，编码这些酶的多核苷酸，和利用这些酶和生物生产1，3-丙二醇的方法。2 背景1，3-丙二醇是一种在生产聚酯纤维和生产聚氨脂和环状化合物中使用的单体。1，3-丙二醇的多种合成途径是周知的。例如，1，3-丙二醇能如下合成(1)在磷化氢、水、一氧化碳、氢和一种酸的存在下，利用催化剂转化环氧乙烷；(2)丙烯醛的催化溶液相水合，随后还原；(3)在一氧化碳和氢存在下，利用具有元素周期表中VIII组原子的催化剂反应一种碳氢化合物(例如甘油)。然而，传统化学合成法是昂贵的，并且产生含有环境污染物的废液，因而绝非理想的。发展便宜并且更加利于环境的生产1，3-丙二醇的备选方法和试剂是所希望的。一种备选方法在体内(即，在微生物中)或在体外使用酶催化甘油发酵为1，3-丙二醇。参见，例如，WO98/21339，WO98/21341和US专利号5,821,092、5,254,467、5,633,362和5,686,276。能由甘油产生1，3-丙二醇的菌株在例如柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、梭菌属(Clostridium)、肠杆菌属(Enterobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、乳杆菌属(Lactobacillus)和暗杆菌属(Pelobacter)中发现。这些细菌通过两步酶催化反应将甘油转化为1，3-丙二醇。第一步，脱水酶催化甘油转化为3-羟基-丙醛(3-HP)和水(方程式1)。第二步，3-HP被NAD+-连接的氧化还原酶还原为1，3-丙二醇(方程式2)。甘油 3-HP+H2O (方程式1)3-HP+NADH+H+1，3-丙二醇+NAD+(方程式2)1，3-丙二醇不被进一步代谢，因此能在基质中积累到高浓度。总反应导致还原的b-烟碱腺嘌呤二核苷酸(NADH)氧化为烟碱腺嘌呤二核苷酸(NAD+)。甘油向1，3-丙二醇的生物转化通常在厌氧条件下进行，用甘油作为唯一的碳源，并且不存在其它的外源还原等价受体。在某些菌株中，如在某些柠檬酸杆菌属、梭菌属和克雷伯氏菌属菌株中，甘油代谢的一个平行途径在运转，首先包括甘油被NAD+-(或NADP+)连接的甘油脱氢酶氧化为二羟丙酮(DHA)(方程式3)。DHA在被DHA激酶磷酸化为磷酸二羟丙酮(DHAP)后(方程式4)，可用于生物合成和支持通过如糖酵解产生ATP。(方程式3)(方程式4)与1，3-丙二醇途径不同，该途径可为细胞提供碳和能量，并且产生而不是消耗NADH。在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)中，在dha调节子中发现编码甘油脱水酶(dhaBCE)、1，3-丙二醇氧化还原酶(dhaT)、甘油脱氢酶(dhaD)和二羟丙酮激酶(dhaK)的功能上相关连的活性的基因。来自柠檬酸杆菌属和克雷伯氏菌属的dha调节子已经在大肠杆菌中表达，显示能将甘油转化为1，3-丙二醇(Tong等人，Appl.Environ.Microbiol.573541-46(1991)；Seyfried等人，J.of Bact.1785793-96(1996)；Tobimatsu等人，J.Biol.Chem.27122352-22357(1996))。由于使用生物学方法和试剂生产1，3-丙二醇所固有的潜在优点，需要发展和确定能将甘油和其它碳底物转化为1，3-丙二醇的具有优良特征的新型微生物和酶。本专利技术通过提供优良的微生物和酶以及鉴定其它优良微生物和酶的方法满足了这一需要。3 专利技术概述本专利技术涉及生产1，3-丙二醇的改进的方法和试剂。更具体而言，本专利技术提供能催化甘油发酵为1，3-丙二醇的新型嗜热生物和热稳定酶。本专利技术也涉及分离这些嗜热生物的方法，克隆编码这些酶的多核苷酸的方法，编码这些酶的多核苷酸，和利用这些酶和生物生产1，3-丙二醇的方法。一方面，本专利技术提供一种在嗜热生物中将甘油转化为1，3-丙二醇的方法，该方法包括提供一种可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物；在可产生1，3-丙二醇的条件下培养这种嗜热生物。在一个优选实施方案中，该方法还包括收集嗜热生物产生的1，3-丙二醇的步骤。在另一个优选实施方案中，该嗜热生物是Caloramator viterbiensis，其中由保藏为ATCC号PTA-584的生物衍生的嗜热生物是特别优选的。本专利技术还提供一种由甘油生产1，3-丙二醇的方法，该方法包括将甘油与热稳定的脱水酶一起温育，由此将甘油转化为3-羟基丙醛；将3-羟基丙醛还原为1，3-丙二醇。在一个优选实施方案中，3-羟基丙醛向1，3-丙二醇的还原由一种热稳定的1，3-丙二醇氧化还原酶催化。在另一个优选实施方案中，该方法还包括收集1，3-丙二醇的步骤。在另一个优选实施方案中，热稳定的脱水酶来自一种嗜热生物，如Caloramator viterbiensis，其中由保藏为ATCC号PTA-584的生物衍生的嗜热生物是特别优选的。本专利技术另一方面提供一种来自C.viterbiensis的分离的热稳定甘油发酵酶，其中来自保藏为ATCC号PTA-584的生物的热稳定甘油发酵酶是特别优选的。在特别优选的实施方案中，热稳定甘油发酵酶是一种脱水酶，如甘油脱水酶，或NAD+-连接的氧化还原酶，如1，3-丙二醇氧化还原酶。本专利技术也提供一种分离的热稳定甘油发酵酶，它与来自C.viterbiensis的热稳定甘油发酵酶同源。本专利技术也提供一种分离的C.viterbiensis培养物或细胞。在一个非限制性实施方案中，培养物或细胞的基因组与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组至少85％相同，优选地与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组90％相同，更优选地与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组95％相同，最优选地与保藏为ATCC号PTA-584的生物的基因组至少99％相同。在另一个非限制性实施方案中，培养物或细胞的16SrDNA序列与保藏为ATCC号PTA-584的生物的16S rDNA序列至少95％相同，优选地与保藏为ATCC号PTA-584的生物的16S rDNA序列至少98％相同。另一方面，本专利技术提供一种克隆编码热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列的方法，该方法包括使与已知甘油发酵酶基因的一部分同源的多核苷酸探针与怀疑含有嗜热生物的环境样品的多核苷酸分子杂交；分离与至少一种多核苷酸探针结合的多核苷酸序列。在一个非限制性实施方案中，该方法使用聚合酶链反应扩增与多核苷酸探针结合的多核苷酸序列。在一个优选实施方案中，热稳定甘油发酵酶来自确定其可将甘油发酵为1，3-丙二醇的嗜热生物，其中C.viterbiensis是特别优选的。在另一个优选实施方案中，多核苷酸探针与已知dhaB基因的一部分同源，其中与来自克雷伯氏菌属的dhaB基因同源的探针是特别优选的。本专利技术还提供一种克隆编码热稳定甘油发酵酶的多核苷酸序列的方法，该方法包括用来自嗜热生物的DNA转化一种不能在甘油上厌氧生长的靶生物；本文档来自技高网...

【技术保护点】
在嗜热生物中将甘油转化为１，３－丙二醇的一种方法，该方法包括：提供一种可将甘油发酵为１，３－丙二醇的嗜热生物；和在可产生１，３－丙二醇的条件下培养该嗜热生物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M瑟费尔德，J维戈尔，G怀特狄，
申请(专利权)人：金克克国际有限公司，佐治亚州大学研究基金会，
类型：发明
国别省市：US[美国]