一种快速检测生物样品中β*—受体兴奋剂的方法及其应用技术

本发明专利技术提供的快速检测生物样品中β＃－［２］－受体兴奋剂的方法，是将衍生化固相微萃取技术与气相色谱／质谱联用，利用待测物对固相微萃取纤维表面涂层的吸附亲和力，使其从样品中分离，并富集于ＳＰＭＥ纤维上；再将纤维置于衍生剂的气相顶空中进行衍生化反应；最后于ＧＣ／ＭＳ系统中检测，采用选择离子检测方式，以峰面积定量，用所得峰面积对照标准曲线计算出待测样品中β＃－［２］－受体兴奋剂的浓度；具有操作简单、分析快速、准确性好、灵敏度高、所需有机溶剂少、经济、无毒害、无污染等优点。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种生物样品中β2-受体兴奋剂的快速检测方法，特别是克仑特罗的快速检测方法。
技术介绍
β2-肾上腺素受体兴奋剂(以下简称β2-受体兴奋剂)是一类人工合成的药物，可选择性地作用于β2-肾上腺素受体，在治疗剂量下有强而持久地松弛支气管平滑肌的作用，临床上用于防治支气管哮喘型慢性支气管炎、肺气肿等呼吸系统疾病所致的支气管痉挛。当作为饲料添加剂的一种成份大剂量用于家畜饲养时，可使家畜体内能量从脂肪组织向肌肉组织转移，促进家畜肌肉组织蛋白质的合成，加速脂肪的转化和分解，使家畜生长速度加快，瘦肉相对增加，但其在家畜内脏及肌肉组织中的残留可严重危害人类健康，过量摄入人体可引起交感神经兴奋，出现肌肉震颤，心慌，头昏，头痛，呕吐等中毒症状，对高血压、心脏病等疾病患者甚至可导致死亡(Gas chromatography-mass spectrometry analysis of β2-agoinst in bovine retina，Anal.Chim.Acta.，2000，408285-290)。克仑特罗(化学名为羟甲叔丁基肾上腺素)是最常使用的β2-受体兴奋剂之一。一般来说，饲料中添加适量克伦特罗后，可使畜禽生长速率、饲料转化率、胴体瘦肉率提高10％以上，所以又将其称为″瘦肉精″。克仑特罗进入人体后分布快、代谢缓慢，易引起中毒。1990年西班牙发生了第1例克仑特罗中毒的报道，患者是在食用含有克仑特罗的动物肝脏后出现肌肉震颤、心动过速、心悸、眩晕等症状，持续时间平均为40小时。于是国际上颁布法规禁止将β2-受体兴奋剂作为生长促进剂使用，世界卫生组织也规定了农畜产品中克仑特罗的最高残留限量为1μg/l(maximum residual level，MRL)。1998年5月，香港居民因食用内地供应的猪内脏，造成17人中毒的“瘦肉精”中毒事件。我国农业部发文“严禁生产和使用β-兴奋剂类产品和未经农业部批准的兽药及饲料药物添加剂”，并于1999年发布《中华人民共和国动物及动物源食品中残留物质监控计划》明令禁止在家畜饲养中使用β2-受体兴奋剂。但由于缺乏快速、准确、灵敏的检测畜产品中β2-受体兴奋剂残留量的方法和标准，在一定程度上给查禁工作带来困难，中毒事件仍时有发生。最近，广东、浙江发生的数起“毒猪肉”中毒事件就是因为食用了含“瘦肉精”的猪肉或猪内脏所致。因此如何快速、准确地测定克仑特罗在食品中残留水平成为我国食品卫生部门、检验检疫部门所关注的问题。目前已有的检测β2-受体兴奋剂的方法包括酶联免疫分析法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱/质谱法(GC/MS)。其中酶联免疫分析法速度快、灵敏度高(检出限可达0.1μg/l)，但由于存在较高的假阳性率，只能用作筛选方法；高效液相色谱法准确性较好，但灵敏度较低(检出限仅为1mg/l)，限制了该法在实际检测中的应用；目前多采用GC/MS法作为确证方法，但该法采用固相萃取(SPE)对样品进行前处理，操作过程繁琐，需要大量有机溶剂。现有检测方法的局限性和不足，在一定程度上限制了对包括克仑特罗在内的β2-受体兴奋剂的有效监测。因此，寻找一种速度快、准确性好、灵敏度高、假阳性率低、操作简单、有机溶剂消耗少的检测β2-受体兴奋剂的新方法，是该领域当前所共同面临的课题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法及其在盐酸克仑特罗检测中的应用，使其具有速度快、准确性好、灵敏度高、假阳性率低、操作简单、有机溶剂消耗少等优点，以克服现有检测方法的不足。本专利技术提供的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法依次包括以下步骤a.将待检测的生物样品经葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶酶解，使其中所含结合状态的β2-受体兴奋剂变为游离态；b.以固相微萃取方法对样品中的β2-受体兴奋剂进行萃取；c.将萃取后的固相微萃取纤维立即进行衍生化反应；d.将吸附了待测物后经衍生化反应的固相微萃取纤维插入气相色谱/质谱(GC/MS)进样器中解析，质谱采用电子轰击(Electron Impact Ion Source，EI)电离方式；采用选择离子检测方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面积定量，用SIM所得峰面积对照标准曲线计算出待测样品中β2-受体兴奋剂的浓度。本专利技术快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂方法的具体实施方法是1.酶解，即步骤a 生物样品需要经葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶的酶解，因摄入生物体内的β2-受体兴奋剂部分会与葡萄糖醛酸或硫酸根结合以结合物的形式存在，亲水性强，不能被SPME纤维有效地萃取，酶解使这部分结合状态的β2-受体兴奋剂变为游离态，更易于被SPME纤维所吸附。尿样需用乙酸调节pH值到5.2，加入β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶于37℃水浴中孵育1小时；组织样(肝脏、肺、肌肉组织等)经绞碎、匀浆后，用乙酸调节pH值到5.2，加入β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶于37℃水浴中孵育1小时，然后过滤。2.萃取，即步骤b取8ml待测样品(尿样或组织样滤液)于洁净10ml萃取小瓶中(预先放入磁力搅拌子)，在搅拌(磁力搅拌子)状态下直接用SPME装置进行萃取。通过试验(如正交试验)确定溶液最佳pH值、最佳盐浓度、最佳萃取温度及最佳萃取时间，以获得最大萃取量。萃取时间选择萃取达到平衡的时间(即待测物在固相涂层/液相之间分配达到平衡状态的时间)，如果平衡时间过长也可以选择非平衡点萃取，但此时要获得较好的重现性需控制萃取时间严格一致。pH值的选择应使待测物在溶液中呈中性分子形式，而非带电荷的离子形式，这样易于被SPME纤维吸附，β2-受体兴奋剂多为碱性物质，因而在碱性条件下多以中性分子形式存在，有较大萃取量。在溶液中加盐(NaCl或Na2SO4)可提高溶液的离子强度，从而提高β2-受体兴奋剂的固相涂层/液相分配系数，可增加萃取量。3.衍生，即步骤cβ2-受体兴奋剂的衍生多用硅烷化试剂，硅烷化试剂遇水会发生反应，采用顶空气相衍生化(Headspace Derivazation，HSD)方式可避免衍生剂与水溶液直接接触，同时也避免了纤维与衍生剂液体的直接接触，防止衍生剂对纤维涂层造成损害。萃取后的SPME纤维立即插入预先封有5μl衍生剂的小瓶(体积为2ml)中，将纤维暴露于衍生剂气相顶空中，于60℃衍生反应10min。衍生反应时间和温度需经优化，以使衍生反应进行完全。4.解析测定，即步骤d将吸附了待测物的纤维插入GC/MS的进样器中，于270℃解析3min。解析温度和解析时间需经优化，以使解析完全；离子化采用电子轰击(Electron Impact Ion Source，EI)电离或化学离子化；采用选择离子检测方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面积定量，用SIM所得峰面积对照标准曲线计算出待测样品中β2-受体兴奋剂的浓度。当所检测的β2-受体兴奋剂为克仑特罗时，其固相微萃取方法是使用带有聚丙烯酸酯(PA)涂层纤维萃取头的固相微萃取装置，以直接法，即将纤维萃取头直接插入样品中进行萃取；所说的衍生化反应是以N，O-双三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生剂，采用顶空衍生法进行衍生化反应；所说的选择离子检测方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测生物样品中β↓［２］－受体兴奋剂的方法，其特征在于依次包括以下步骤：ａ．将待检测的生物样品经葡萄糖醛甙酶／硫酸酯酶酶解，使其中所含结合状态的β↓［２］－受体兴奋剂变为游离态；ｂ．以固相微萃取方法对样品中的β↓［２ ］－受体兴奋剂进行萃取；ｃ．将萃取后的固相微萃取纤维立即进行衍生化反应；ｄ．将吸附了待测物后经衍生化反应的固相微萃取纤维插入气相色谱／质谱（ＧＣ／ＭＳ）进样器中解析，离子化，采用选择离子检测方式（ｓｅｌｅｃｔｅｄ　ｉｏｎ　ｍ ｏｎｉｔｏｒｉｎｇ，ＳＩＭ），以峰面积定量，用ＳＩＭ所得峰面积对照标准曲线计算出待测样品中β↓［２］－受体兴奋剂的浓度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁亚莉，胡小钟，殷斌志，严志刚，余建新，林雁飞，刘红卫，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]