一种基于海洋环肽Samoamide A的改造多肽、合成方法及应用技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种基于海洋环肽Samoamide A的改造多肽、合成方法及应用，所述活性肽的结构为：环‑(Leu‑Pro‑Pro‑(4‑Br‑Phe)‑Ile‑Pro‑(4‑Br‑Phe)‑Val)。合成方法包括以下步骤：1)采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有直链肽；2)向树脂中加入切割液反应，收集反应后溶液，向所述溶液中滴加DIEA调节pH值呈中性，得到直链肽的粗品溶液；3)将直链肽粗品溶液滴加入环肽反应体系中，合成环肽。本发明专利技术通过两个Br‑苯丙氨酸来替换原Samoamide A环肽中的两个苯丙氨酸，并通过合适的固相合成方法得到基于的Samoamide A的衍生物SamoamideB，制备的SamoamideB针对DPP‑4酶活抑制率以及对肿瘤细胞毒性均得到显著的提高，体现出更优异的抗肿瘤活性。

【技术实现步骤摘要】
一种基于海洋环肽SamoamideA的改造多肽、合成方法及应用
本专利技术属于生物
，具体的涉及基于海洋环肽SamoamideA的改造多肽、合成方法及应用。
技术介绍
多肽类化合物因具有毒性低、靶向特异性明确和分子质量小等优点，已经成为抗肿瘤化学药物的一个重要研究方向。尤其是环肽化合物因为具有体内半衰期长、结构较稳定和细胞穿膜性强等特点，愈加受到研究人员的关注。SamoamideA[-(Leu-Pro-Pro-Phe-Ile-Pro-Phe-Val)-]是从海洋藻类中天然提取的一条环肽，并且对肿瘤细胞具有良好的毒性效果。但是天然提取的SamoamideA提取产率较低且活性较差，无法规模化生产及应用，因此需要专利技术一种固相合成的方法使提高产率，同时能够提高其活性，使其得到更广泛的应用。多肽化学合成方法分为液相合成和固相合成两种，早期时主要是采用液相法来合成多肽，液相法具有合成产物纯度较高等优点，但是，其合成反应操作比较复杂，而且有些氨基酸难溶解，这些障碍制约了液相合成法的应用。直到1963年，Merirfield专利技术了多肽的固相合成方法，与传统的液相合成法相比，固相合成法具有快速、操作简便和高产率等优点，利用其可以合成各种多肽，特别是近些年来，固相合成多肽方法在固相载体、保护基、缩合方法和切割条件等方面的取得了较好的方展，固相法越来越受到重视。因此，利用化学方法合成多肽，不仅对多肽合成方法的理论研究具有重大的意义，而且可以推动药物的发展，尤其是抗肿瘤药物方面的研究。经检索，针对SamoamideA的固相合成方法，现有技术已有相关的申请案公开，如中国专利申请号为201810931188.X，公开日期为2019年1月8日的申请案公开了一种藻青菌环八肽SamoamideA的制备方法，包括以下步骤：(1)在耦合试剂下，Fmoc-Val-OH与树脂固相载体偶联，得FmocVal-树脂；(2)利用脱保护剂脱除Fmoc基团；(3)在缩合剂和活化试剂作用下，将具有N端Fmoc保护的氨基酸偶联到树脂上；其中，所述具有N端Fmoc保护的氨基酸依次为Fmoc-Phe-OH、FmocPro-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-ProOH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH；(4)重复(2)、(3)步骤，得到全肽树脂；(5)利用切割试剂将肽链从肽树脂上脱下，使之沉淀得直链肽粗品；(6)取直链肽，利用缩合剂环合直链肽(7)分离纯化，得SamoamideA。上述申请案的固相合成方法相对天然方式相比虽然显著改善了SamoamideA的收率，然而针对于SamoamideA的活性并未进行研究，亟需专利技术一种活性提高的改造多肽及新的合成方法。
技术实现思路
1.要解决的问题针对从海洋藻类中天然提取的一条环肽SamoamideA存在的抗肿瘤活性不佳的缺陷，本专利技术提供一种利用两个4-Br-Phe来替换原SamoamideA环肽中的两个苯丙氨酸，得到基于的SamoamideA的改造多肽SamoamideB，所述的SamoamideB相对SamoamideA体现出更优异的抗肿瘤活性。2.技术方案为了解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：本专利技术提供了一种基于海洋环肽SamoamideA改造的多肽，所述多肽的结构为：环-(Leu-Pro-Pro-(4-Br-Phe)-Ile-Pro-(4-Br-Phe)-Val)。优选的方案，所述的基于海洋环肽SamoamideA改造的多肽的合成方法，包括以下步骤：1)采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有直链肽；2)向步骤1)反应后的树脂中加入切割液进行反应，收集反应后溶液，向所述溶液中滴加N,N-二异丙基乙胺调节pH值呈中性，得到直链肽NH2-Leu-Pro-Pro-(4-Br-Phe)-Ile-Pro-(4-Br-Phe)-Val-OH的粗品溶液；3)将所述直链肽粗品溶液滴加入环肽合成反应体系中，合成环肽；4)减压蒸发除去溶剂，得到浓缩的活性肽产物。优选的方案，所述树脂包括2-氯三苯甲基氯树脂。优选的方案，所述的切割液为含有三氟乙酸的二氯甲烷溶液，所述三氟乙酸的质量份数为1％。优选的方案，所述环肽合成反应体系为含有二氯甲烷、1-羟基苯并三氮唑以及N,N-二异丙基乙胺的混合液。优选的方案，所述树脂与氨基酸的偶联反应中，包括以下步骤：a)首先向树脂中投加第一个氨基酸Fmoc-Val-OH，以二氯甲烷作为反应试剂，以N,N-二异丙基乙胺作为缩合试剂反应一段时间进行第一个氨基酸的连接，连接完成后重新加入二氯甲烷，滴加无水甲醇和N,N-二异丙基乙胺鼓吹反应一段时间，对树脂未反应的位点进行封头处理；b)向步骤a)反应完成的树脂中加入哌啶与二甲基甲酰胺的混合溶液，进行氨基酸脱Fmoc基团反应；c)重复上述步骤，依次投入Fmoc-4-Br-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Ile-OH，Fmoc-4-Br-Phe-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Pro-OH，Fmoc-Leu-OH进行反应，依次完成相应氨基酸的连接。优选的方案，所述第一个氨基酸的投加质量按照M＝树脂的质量×0.3×氨基酸分子量×1.33计算。优选的方案，所述方法还包括步骤5)分离纯化：用乙腈和纯水溶解之后过滤，将过滤溶液采用高效液相色谱进行分离纯化，接取目标峰、冷冻干燥得到产物。优选的方案，本专利技术提供了一种药物组合物，包括所述的基于海洋环肽SamoamideA改造的多肽，和药学可接受的载体或赋形剂。优选的方案，所述的抗肿瘤活性肽的合成方法，具体包括以下步骤：(1)树脂与氨基酸偶联反应称量2-氯三苯甲基氯树脂2.00g投入到多肽合成砂芯管内。加入DMF用旋片式真空泵通入空气鼓吹洗涤5～10s，再用循环水式多用真空泵抽滤干净液体，加入DCM浸泡树脂鼓吹2～3min使其充分膨胀后抽滤。称取Fmoc-Val-OH451.4mg投入到砂芯管内，加入DCM作为反应溶剂，滴加1mLDIEA作为缩合试剂，室温下鼓吹反应30min后抽干净液体，加入DMF洗涤4遍并抽滤。重新加入DCM，滴加4mL无水甲醇和4mLDIEA鼓吹反应30min，对树脂未反应的位点进行封头处理。待反应结束后抽滤，加入DMF洗涤4遍。(2)直链肽合成在砂芯管内加入哌啶溶液(哌啶：DMF＝1:4，体积比)，鼓吹反应15min后抽滤，进行氨基酸脱Fmoc基团反应。反应结束后先加入DMF洗涤5～10s，再加入甲醇洗涤5～10s，重复2便，最后加入DMF洗涤2遍。印三酮显色反应检测：用干净的细铁丝从砂芯管内蘸取一点树脂放入检测管内，滴加Kaiser试剂(6％印三酮乙醇溶液：80％苯酚乙醇溶液：吡啶＝2:1:1，体积比)，将检测管放入100℃温浴仪中加热反应2min后观察颜色。若检测管内的树脂呈深蓝色，则说明氨基酸脱Fmoc成功，可继续进行过反应。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于海洋环肽Samoamide A的改造多肽，其特征在于：所述多肽的结构为：环-(Leu-Pro-Pro-(4-Br-Phe)-Ile-Pro-(4-Br-Phe)-Val)。/n

【技术特征摘要】
1.一种基于海洋环肽SamoamideA的改造多肽，其特征在于：所述多肽的结构为：环-(Leu-Pro-Pro-(4-Br-Phe)-Ile-Pro-(4-Br-Phe)-Val)。


2.权利要求1所述的基于海洋环肽SamoamideA的改造多肽的合成方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)采用树脂与氨基酸进行偶联反应，使树脂上偶联有直链肽；
2)向步骤1)反应后的树脂中加入切割液进行反应，收集反应后溶液，向所述溶液中滴加N,N-二异丙基乙胺调节pH值呈中性，得到直链肽NH2-Leu-Pro-Pro-(4-Br-Phe)-Ile-Pro-(4-Br-Phe)-Val-OH的粗品溶液；
3)将所述粗品溶液滴加入环肽合成反应体系中，合成环肽；
4)减压蒸发除去溶剂，得到浓缩的活性肽产物。


3.根据权利要求2所述的基于海洋环肽SamoamideA的改造多肽的合成方法，其特征在于：所述树脂包括2-氯三苯甲基氯树脂。


4.根据权利要求2或3所述的基于海洋环肽SamoamideA的改造多肽的合成方法，其特征在于：所述的切割液为含有三氟乙酸的二氯甲烷溶液，所述三氟乙酸的质量份数为1％。


5.根据权利要求4所述的基于海洋环肽SamoamideA的改造多肽的合成方法，其特征在于：所述环肽合成反应体系为含有二氯甲烷、1-羟基苯并三氮唑以及N,N-二异丙基乙胺的混合液。


6.根据权利要求5所述的基于海洋环肽SamoamideA的改造多肽的合成...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛飞，陈刘旺，李婉珍，陶玉贵，宋平，朱龙宝，张伟伟，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34