【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一种源自费氏链霉菌的环氧化物水解酶、基因、重组载体、工程菌及其应用。
技术介绍
1、环氧化物水解酶(epoxide hydrolases,ec 3.3.2.-)，来自酶家族，其以不对称方式将环氧化物水解为相应的邻二醇。这些酶存在于许多生物体中，如细菌、植物、真菌和昆虫。而环氧化物也是合成生物活性分子的关键合成子，如hiv蛋白酶抑制剂、β肾上腺素能受体阻断药物、神经保护剂和钙通道阻滞剂。(s)-苄基甘油醚是一种多用途的中间体，存在于许多重要的药物化合物中，比如可以用来进一步合成过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂，其在ii型糖尿病的治疗中起着重要作用(tetrahedron lett.2014,55:3223–3226)。由于环氧化物水解酶在自然界中的广泛存在，在水解过程中对辅因子的依赖性不强，以及利用表达环氧化物水解酶的全细胞作为催化剂的能力，及环氧化物水解酶自身具备的来源广泛、绿色环保和高立体选择性等优点，也越来越多的环氧化物水解酶被开发，同时越来越多的以环氧化物水解酶为基础的环氧化物酶促水解反应被研究。
2、近年来链霉菌基因组序列数据的爆炸式增长揭示了丰富而有价值的天然产物来源，包括抗生素、维生素、酶等。随着基因组学的发展，越来越多的植物、脊椎动物、无脊椎动物、微生物和宏基因组学的环氧化物水解酶被表征出来。基于这些研究结果，某种环氧化物水解酶几乎不可能对所有环氧化物类型表现出令人满意的催化性能，同时随着生物信息学的快速发展、基因序列信息的长期积累以及基因工程技术的进步，快速获得新的环氧
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种源自费氏链霉菌的环氧化物水解酶、基因、重组载体、工程菌及其应用，通过构建新的环氧化物水解酶，便于对苄基缩水甘油醚进行手性拆分。
2、基于上述目的，本专利技术提供了一种源自费氏链霉菌的环氧化物水解酶，所述环氧化物水解酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
3、所述氨基酸序列是经替换、添加或遗失一个或若干氨基酸残基得到的，且编码具有环氧化物水解酶活性的由所述氨基酸序列衍生的蛋白质。本申请的环氧化物水解酶具备：同所限定的氨基酸序列拥有≥94％同源性且具有环氧化物水解酶活性的蛋白质。
4、本专利技术还提供一种编码所述源自费氏链霉菌环氧化物水解酶的基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，经密码子优化基因的序列如seq id no.2所示。
5、本专利技术还提供一种含所述密码子优化基因的克隆载体、表达载体和工程菌。
6、所述工程菌是以真菌或细菌为宿主构建表达得到的。
7、专利技术还提供所述源自费氏链霉菌环氧化物水解酶的工程菌的制备方法，包括如下步骤：
8、步骤一、依据e.coli bl21(de3)系列菌株的密码子偏好性进行密码子优化以得到如seq id no.2所示sfeh2基因的核苷酸序列；
9、步骤二、以步骤一得到的sfeh2基因的核苷酸序列为模板进行pcr扩增，将扩增产物连接表达载体pcold ii得到重组表达质粒pcold ii-sfeh2
10、步骤三、将重组表达质粒pcold ii-sfeh2导入e.coli bl21(de3)中，得到待表达的工程菌e.coli/sfeh2。
11、本专利技术还提供所述环氧化物水解酶、编码所述源自费氏链霉菌的环氧化物水解酶的经密码子优化后基因、含所述基因的克隆载体与表达载体、含所述优化后基因的工程菌在苄基缩水甘油醚手性拆分的应用。
12、优选的，所述应用是以所述环氧化物水解酶和/或表达所述环氧化物水解酶的工程菌为催化剂，以外消旋苄基缩水甘油醚为底物，20～35℃、ph 5.5～8.0的环境中进行不对称催化反应。将纯酶或用na2hpo4-nah2po4磷酸缓冲液(100mm，ph 7.0)重新悬浮的e.coli/sfeh2新鲜细胞，制成一定浓度的、均匀的细胞酶悬浮液，向其加入一定量的环氧化物使其终浓度达到20mm，将体系放置于20～35℃、ph 5.5～8.0的环境(优选的，温度为30℃、ph为7.0的na2hpo4-nah2po4缓冲液)中进行不对称催化。
13、以20～50mg/ml的工程菌e.coli/sfeh2冻干全细胞催化浓度在150mm以内的外消旋苄基缩水甘油醚的手性拆分反应，可获得ee＞99％的高光学纯度的s构型苄基缩水甘油醚。
14、优选的，所述应用是以rac-15a(苄基缩水甘油醚)为底物原料，在100mm的钠盐磷酸盐缓冲体系(e.coli/sfeh2冻干细胞50mg/ml、150mm的rac-15a以及tween-20(1％,v/v)，ph 7.0)中进行，反应温度为30℃。
15、本专利技术的有益效果：本专利技术提供了一种streptomyces fradiae来源的新型环氧化物水解酶，命名为sfeh2，其相应的基因命名为sfeh2。sfeh2底物谱较为广泛，能够催化多种单取代环氧化物的不对称水解反应，特别是在表达有重组sfeh2的e.coli/sfeh2全细胞催化150mm及以下浓度的rac-15a的动力学拆分反应过程中，可以获得高光学纯度(ee>99％)的(s)-15a，产率可达40％以上，且具有较高水平的时空产率(space time yield,sty)。因此，sfeh2与其重组工程菌e.coli/sfeh2具备较大的应用潜力及社会经济价值。
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1.一种源自费氏链霉菌的环氧化物水解酶，其特征在于，所述环氧化物水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.一种编码权利要求1所述源自费氏链霉菌的环氧化物水解酶基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，经密码子优化后基因的序列如SEQ ID NO.2所示。
3.一种含权利要求2所述优化后基因的克隆载体与表达载体。
4.一种含权利要求2所述优化后基因的工程菌。
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以真菌或细菌为宿主构建表达得到的。
6.根据权利要求1所述环氧化物水解酶、编码所述源自费氏链霉菌的环氧化物水解酶的经密码子优化后基因、含所述基因的克隆载体与表达载体、含所述优化后基因的工程菌在苄基缩水甘油醚手性拆分的应用。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述应用是以所述环氧化物水解酶和/或表达所述环氧化物水解酶的工程菌为催化剂，以外消旋苄基缩水甘油醚为底物，20～35℃、pH5.5～8.0的环境中进行不对称催化反应。
8.根据权利要求7所述应
...【技术特征摘要】
1.一种源自费氏链霉菌的环氧化物水解酶，其特征在于，所述环氧化物水解酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
2.一种编码权利要求1所述源自费氏链霉菌的环氧化物水解酶基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，经密码子优化后基因的序列如seq id no.2所示。
3.一种含权利要求2所述优化后基因的克隆载体与表达载体。
4.一种含权利要求2所述优化后基因的工程菌。
5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌是以真菌或细菌为宿主构建表达得到的。
6.根据权利要求1所述环氧化物水解酶、编码所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：李闯，张贤，王雨晴，薛正莲，黄瑞，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：
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