肽类化合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术属于药物化学技术领域。本发明专利技术公开了一种具有肿瘤细胞抑制活性的线性肽或环肽，其含有犬尿氨酸和精氨酸的缩合片段。本发明专利技术还运用一种从复杂提取物中选择性识别含犬尿氨酸的环肽类化合物的质谱快速定位方法，从棕色扁海绵中分离获得一种具有抗肿瘤活性的新环肽类化合物。并且运用固相合成，液相环化及最后阶段的臭氧化策略实现了对本发明专利技术化合物的全合成。

【技术实现步骤摘要】
肽类化合物及其制备方法与应用
本专利技术涉及属于药物化学
，尤其是涉及一种肽类化合物及其制备方法与应用。
技术介绍
海绵是最古老最简单的多细胞动物，有5亿多年的演化史，依靠过滤海水取食，缺乏真正的组织，不能移动并缺乏物理防御。在海洋严酷的竞争环境中，海绵通过产生活性次级代谢产物来防御外来生物攻击。海绵是海洋新化合物最多产和最重要的来源之一，自20世纪60年代开始研究海洋天然产物以来，每年从海绵中发现结构新颖的活性物质约占海洋天然产物的三分之一。目前国内外共有49个来源于海洋的活性物质被批准上市或进入临床，其中有14个源自海绵(上市3个)，因此，海绵已成为海洋药物的重要来源，一直是海洋天然产物化学家的研究热点。海绵是海洋活性肽的重要来源，主要包括线性肽，缩酚酸肽和环肽。其中环肽类化合物是一类以酰胺键形成的环状化合物，主要是由氨基酸、糖肽、脂肽和核苷肽经过一系列修饰后组合而成的复杂分子。环肽类化合物作为药物分子，具有抗癌、抗病毒、抗菌、免疫抑制等广泛的生物活性。因此，针对环肽类药物的研究正在受到人们越来越多的关注。目前共有40多种环肽类药物用于临床，近十年，平均每年约有一种环肽类药物批准上市，占同时期上市新药总数的3％。环肽类化合物之所以在药物研发领域大展身手，与其几大特性相关。首先，由于环状结构导致的构象变化限制，环肽类化合物一般具有较大的表面积，从而使其与靶点蛋白间具有高度亲和力及识别特异性。大环结构构象灵活性的限制也降低了药物与靶点结合的熵值，提高了结合的稳定性。其次，氨基酸组成特点决定了环肽类化合物往往具有极低的、甚至没有细胞毒性。第三，环肽类化合物很容易通过自动化的化学合成流程实现生产，并且便于进行各项修饰、处理及监控，这些特点都非常有利于药物开发过程。尽管环肽类化合物具有广阔的市场应用前景，但海绵来源的环肽类化合物在生物体内大多含量低微，其定向获取极富挑战。若单靠活性指导下的追踪分离往往由于对特异性成分的灵敏度不够，易产生错误导向，且步骤复杂，费时费力，通量低，容易导致微量活性成分的遗漏，极大限制了海绵中含量低微、结构新颖、活性显著的环肽类天然产物的发现进程。近年来，由于质谱技术的快速发展，极大推动了海洋天然产物的发现速度。特别是复合型液相串联三重四极杆质谱(Q-Q-Q)，通过母离子扫描、子离子扫描、中性丢失扫描和多离子反应监测等功能，大大提高了从复杂天然提取物中发现微量活性成分的灵敏度及选择性。其中，中性丢失扫描是指Q1和Q3同时进行全扫描，但是二者始终保持一定固定的质量差，只有在碰撞池Q2中丢失的中性部分满足这个固定质量差的离子才能被检测到。基于环肽类化合物丢失固定中性碎片的特点结合质谱中性丢失扫描功能，建立环肽类特征结构的质谱快速定位方法，快速筛选出复杂提取物中含有该骨架片段的新颖环肽类化合物，这将为海洋来源复杂化合物的相关研究提供新的研究思路，加快海洋药物开发的速度。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于公开一种肽类化合物，其为具有肿瘤细胞抑制活性的线性肽或环肽，其含有以下犬尿氨酸和精氨酸的缩合片段：较佳的，其由3～20优选4～12个氨基酸组成。进一步的，其为以下化合物1～6中的一种：本专利技术的第二目的在于提供两种制备所述的肽类化合物的方法。其中一种制备方法是从海绵中提取并分离制得，本专利技术的提取分离方法包括提取、萃取、分离富集、色谱纯化等步骤。具体的一些实施例中，包括以下步骤：(a)提取：将海绵粉碎后，用有机溶剂渗漉提取，合并提取液后减压浓缩得到提取液；所述有机溶剂优选乙醇、甲醇、丙醇等醇类溶剂或者两种及以上醇类溶剂的结合；(b)萃取分离：提取液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩得到的浸膏混悬于80～90％优选85～90％的甲醇-水中，用石油醚萃取；将80～90％优选85～90％的甲醇-水层稀释至50～60％优选55％～60％的甲醇-水，用二氯甲烷萃取，合并萃取液并减压浓缩得到二氯甲烷萃取部位；(c)分离富集：采用质谱追踪定位分析，通过凝胶柱层析、反相中压柱色谱和全制备高效液相色谱中的一种或多种方式分离富集含有大分子量化合物的馏分；(d)筛选目标化合物：采用中性丢失扫描质谱法筛选含犬尿氨酸的目标化合物，首先检测馏分中中性丢失190Da的母离子，然后对其进行子离子扫描验证，二级碎片离子中能发现190Da的质量差的即为目标化合物母离子，进而获得其碎片离子信息和色谱保留行为；(e)质谱导向分离：在获得其碎片离子信息和色谱保留行为基础上，采用质谱导向的半制备高液相色谱法对馏分进行分离，得到目标化合物。更具体的，对于化合物1，可通过以下步骤从海绵中提取：(a)提取：将棕色扁海绵粉碎后，用乙醇渗漉提取，合并提取液后减压浓缩得到提取液；(b)萃取分离：提取液用等体积乙酸乙酯萃取3～5次优选3次，合并乙酸乙酯层后浓缩得到的浸膏混悬于80～90％优选85～90％的甲醇-水中，用等体积的石油醚萃取3～5次；将80～90％优选85～90％的甲醇-水层稀释至50～60％的甲醇-水，用等体积的二氯甲烷萃取3～5次优选3次，合并萃取液并减压浓缩得到二氯甲烷萃取部位；(c)分离富集：将上述二氯甲烷萃取部位通过SephadexLH-20凝胶柱层析，用50％的CH2Cl2-MeOH洗脱剂洗脱，并采用质谱定位追踪的方式，将大分子量的化合物进行富集得；采用ODS中压柱色谱分离，用MeOH/H2O梯度(10％-100％，450min)洗脱，采用质谱追踪定位分析，获得含有大分子量的环肽类化合物的精细馏分；(d)筛选目标化合物：采用中性丢失扫描质谱法筛选含犬尿氨酸的目标化合物，首先检测馏分中中性丢失190Da的母离子m/z884.48[M+H]+，对其进行子离子扫描验证，二级碎片离子中能发现190Da的质量差，进而获得其碎片离子信息和色谱保留行为；(e)质谱导向分离：在获得其碎片离子信息和色谱保留行为基础上，采用质谱导向的半制备高液相色谱法对馏分进行分离，得到目标化合物。另一种制备方法是全合成方法，包括以下步骤：(A)按照肽链上的氨基酸序列，将第一种氨基酸装载到2-CTC树脂中：将2-CTC树脂溶胀后，加入Fmoc(9-芴基甲氧基羰基保护基)保护的氨基酸和DIEA(N,N-二异丙基乙胺)，反应完全后洗涤去除未反应的原料；(B)Fmoc脱保护：在室温下，使用含15～30％优选20％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，然后将树脂用DMF洗涤；(C)肽偶联：按照肽链上的氨基酸序列，依次通过以下步骤偶联其余氨基酸：将Fmoc保护的氨基酸、HATU(多肽缩合试剂，系统命名为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)和DIEA在DMF中室温下与树脂轻轻涡旋搅拌，然后将树脂用DMF洗涤；其余氨基酸中的精氨酸和色氨酸的侧链分别由Pbf基团和Boc基团保护；(D)Fmoc脱保护：在室温下，使用含15～30％优选20％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，然后将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肽类化合物，其为具有肿瘤细胞抑制活性的线性肽或环肽，其特征在于，其含有以下犬尿氨酸和精氨酸的缩合片段：/n

【技术特征摘要】
1.一种肽类化合物，其为具有肿瘤细胞抑制活性的线性肽或环肽，其特征在于，其含有以下犬尿氨酸和精氨酸的缩合片段：





2.如权利要求1所述的肽类化合物，其特征在于，其由3～20个氨基酸组成。


3.如权利要求1所述的肽类化合物，其特征在于，其由4～12个氨基酸组成。


4.如权利要求1所述的肽类化合物，其特征在于，其为以下化合物1～6中的一种：








5.一种制备权利要求1～4任一项所述的肽类化合物的方法，其特征在于，所述肽类化合物从海绵中提取并分离制得。


6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，其包括步骤：
(a)提取：将海绵粉碎后，用有机溶剂渗漉提取，合并提取液后减压浓缩得到提取液；
(b)萃取分离：提取液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层浓缩得到的浸膏混悬于80～90％的甲醇-水中，用石油醚萃取；将80～90％的甲醇-水层稀释至50～60％的甲醇-水，用二氯甲烷萃取，合并萃取液并减压浓缩得到二氯甲烷萃取部位；
(c)分离富集：采用质谱追踪定位分析，通过凝胶柱层析、反相中压柱色谱和全制备高效液相色谱中的一种或多种方式分离富集含有大分子量化合物的馏分；
(d)筛选目标化合物：采用中性丢失扫描质谱法筛选目标化合物，首先检测馏分中中性丢失190Da的母离子，然后对其进行子离子扫描验证，二级碎片离子中能发现190Da的质量差的即为目标化合物母离子，进而获得其碎片离子信息和色谱保留行为；
(e)质谱导向分离：在获得其碎片离子信息和色谱保留行为基础上，采用质谱导向的半制备高液相色谱法对馏分进行分离，得到目标化合物。


7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述肽类化合物为权利要求4的化合物1，所述方法步骤具体如下：
(a)提取：将棕色扁海绵粉碎后，用乙醇渗漉提取，合并提取液后减压浓缩得到提取液；
(b)萃取分离：提取液用等体积乙酸乙酯萃取3～5次，合并乙酸乙酯层后浓缩得到的浸膏混悬于80～90％的甲醇-水中，用等体积的石油醚萃取3～5次；将80～90％的甲醇-水层稀释至50～60％的甲醇-水，用等体积的二氯甲烷萃取3～5次，合并萃取液并减压浓缩得到二氯甲烷萃取部位；
(c)分离富集：将上述二氯甲烷萃取部位通过SephadexLH-20凝胶柱层析，用50％的CH2Cl2-MeOH洗脱剂洗脱，并采用质谱定位追踪的方式，将大分子量的化合物进行富集得；采用ODS中压柱色谱分离，用MeOH/H2O梯度(10％-100％，450min)洗脱，采用质谱追踪定位分析，获得含有大分子量的环肽类化合物的精细馏分；
(d)筛选目标化合物：采用中性丢失扫描质谱法筛选目标化合物，首先检测馏分中中性丢失190Da的母离子m/z884.48[M+H]+，对其进行子离子扫描验证，二级碎片离子中能发现190Da的质量差，进而获得其碎片离子信息和色谱保留行为；
(e)质谱导向分离：在获得其碎片离子信息和色谱保留行为基础上，采用质谱导向的半制备高液相色谱法对馏分进行分离，得到目标化合物。


8.一种制备权利要求1～4任一项所述的肽类化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(A)按照肽链上的氨基酸序列，将第一种氨基酸装载到2-CTC树脂中：将2-CTC树脂溶胀后，加入Fmoc保护的氨基酸和DIEA，反应完全后洗涤去除未反应的原料；
(B)Fmoc脱保护：在室温下，使用含15～30％哌啶的DMF溶液进行Fmoc脱保护，然后将树脂用DMF洗涤；
(C)肽偶联：按照肽链上的氨基酸序列，依次通过以下步骤偶联其余氨基酸：将Fmoc保护的氨基酸、HATU和DIEA在DMF中室温下与...

【专利技术属性】
技术研发人员：林厚文，王淑萍，吴莹，孙凡，刘丽云，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：上海;31