在生物样品中检测钙蛋白酶3活性的方法和实施该方法所用的肽技术

本发明专利技术涉及与至少一种荧光或生色的（ｃｏｌｏｒｇｅｎｉｃ）报道分子相偶联的肽，其特征在于它包含至少一种能被钙蛋白酶３裂解的氨基酸序列。本发明专利技术还涉及体外检测生物样品中钙蛋白酶３活性的方法。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及在包含细胞、细胞系或组织的生物样品中检测钙蛋白酶3活性的方法。还涉及该方法中所用的肽。本专利技术还涉及应用所述的肽在体外诊断2A型肢带型肌营养不良症(LGMD 2A)。而且，还涉及分析在体外向动物或人细胞、及在体内向动物中转运钙蛋白酶3基因的效率的方法。此外，还涉及筛选钙蛋白酶3-抑制物或钙蛋白酶3-激活物的方法。最后，检测钙蛋白酶3活性的方法包括研究钙蛋白酶3功能的手段。钙蛋白酶是一个钙激活的、非溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族(Sorimachi，1997)。这个家族目前包含11个成员，其中包括两个遍在蛋白。钙蛋白酶的生理功能大部分仍是未知的。作为调节型的蛋白酶，它们很可能调节重要的细胞功能。具体说来，遍在钙蛋白酶与编程性细胞死亡(Squier，1994)，生肌分化(Kwak，1993)，和细胞分裂及融合相关(Yamaguchi，1994)；(Schollmeyer，1986)；(Balcerzak，1995)。钙蛋白酶3，也称作p94，是一种钙依赖的半胱氨酸酶，属于钙蛋白酶家族，并在骨骼肌中特异表达(Sorimachi，1989)。它与一种被称为2A型肢带型肌营养不良症的常染色体隐性遗传疾病相关(Richard，1995)。这种肌病以萎缩和骨盆的和肩带的肌肉渐进性衰弱为特征，肌肉活组织检查表象为坏死-再生(Fardeau，1996)。该基因定位于人的第15号染色体，编码3.5kb的转录物，该转录物本身编码94kDa的蛋白。已表明钙蛋白酶3可与肌联蛋白，即一种肌节弹性蛋白通过IS2区域相结合，当其在Cos7细胞中表达时，翻译后立即自溶降解(Sorimachi，1993)(Sorimachi，1995)。这一区域中包含核定位信号，这意味着钙蛋白酶可定位于细胞质或细胞核中。另外还已表明钙蛋白酶3在过表达IL-6的转基因小鼠中低表达，这些小鼠表现出肌肉萎缩。钙蛋白酶3还在多种包含肌肉萎缩成分(恶病质，等)的条件下表现为低表达。依照当前的知识水平，由此认为LGMD 2A是由钙蛋白酶3基因的突变导致的，突变导致骨骼肌中存在的钙蛋白3的蛋白水解活性受到抑制。由于患者的临床症状与至少约10种其他的病理状况相类似，因此LGMD 2A的临床诊断非常困难。在分子诊断方面可依照多种方法进行。第一种可能是对钙蛋白酶基因进行突变研究。但是，由于该基因相对较大，所以存在许多不同的突变，且并不存在优先的突变，因此这种技术是相当繁复的。另一种技术包括利用特异的抗体检测该蛋白的存在。但即使样中存在钙蛋白酶3也不能说明该个体没有患病，这是因为钙蛋白酶基因的突变可能意味着虽然该蛋白存在但自溶现象并不存在。另一方面，如果钙蛋白酶不存在或减少，也可能涉及由于钙蛋白酶之外的基因突变造成的继发钙蛋白酶病。换言之，本专利技术所要解决的问题并非仅仅是检测生物样品中钙蛋白酶3的存在，更重要的是检测其活性。Guttmann等在“Methods in molecular biology”vol 144，ch 18中描述了检测遍在钙蛋白酶活性的方法，该方法包括使纯化的钙蛋白酶与非特异的荧光肽(Succ-LLVY-AMC)相接触，然后检测该分子被裂解后荧光的变化。在另一种方法中，将钙蛋白酶与完整的TAU蛋白接触，然后进行蛋白印迹。这篇文章没有以任何方式特异地涉及钙蛋白酶3。另外，所述的底物或是非特异的(m-钙蛋白酶和μ-钙蛋白酶的底物)或是完整蛋白。本专利技术所要解决的问题是开发一种新的特异于钙蛋白酶3的底物，其可用于检测生物样品中钙蛋白酶3的活性。因此，本专利技术首先涉及至少与一种荧光或生色的报道分子相偶联的肽，所述肽的特征在于它包含至少一种能被钙蛋白酶3或钙蛋白酶3的同工型裂解的氨基酸序列。所述的“钙蛋白酶3的同工型”代表任何由钙蛋白酶3基因由于可变启动子的可变事件或可变剪接所产生的蛋白。在第一个实施方案中，鉴于钙蛋白酶3的自溶特性，本专利技术的肽优选地包含至少一个钙蛋白酶3或钙蛋白酶3的同工型的自溶位点，其氨基酸的数量小于10。在说明书的其他部分和权利要求中，“自溶位点”表示在钙蛋白酶3或其同工型之一中所包含的氨基酸序列和任何由此衍生的序列，其可被钙蛋白酶3或其同工型之一裂解成至少两个肽。实践中，钙蛋白酶3自溶位点的氨基酸序列选自下述称作NMTYGTS(SEQ ID 1)，NMDNSLL(SEQ ID 2)和PVQYETR(SEQ ID 3)的序列，在说明书的其他部分分别称作位点1，位点2和位点3。这些位点在目前所有钙蛋白酶3序列已知的物种(人，小鼠，大鼠)中都是同一的。钙蛋白酶3自溶位点的氨基酸序列也可以选自下述人序列VAPRTAAEPRSP(SEQ ID 4)，QSKATE AGGGNP(SEQ ID 5)，和下述的鼠序列VAPRTG AEPRSP(SEQ ID 6)，QGKTTE AGGGHP(SEQ ID 7)。在所述的实施方案中，本专利技术的肽包含至少一个钙蛋白酶3同工型的自溶位点，所述自溶位点的氨基酸序列来源于存在于啮齿动物，大鼠和小鼠中的称作Lp82的钙蛋白酶3同工型，并选自下述的氨基酸序列NPYLLPGFFC(SEQ ID 8)和TISVDRPVP(SEQ ID 9)。在第二个实施方案中，可被钙蛋白酶3或其同工型裂解的氨基酸序列来自底物蛋白，如钙蛋白酶抑制蛋白，细丝蛋白，踝蛋白，遍在钙蛋白酶，晶体蛋白(crystalline)，热激蛋白等。优选地，所述底物蛋白具有下述序列REVTIPPKYRELL(SEQ ID 10)(人钙蛋白酶抑制蛋白)KEGTIPPEYRKLL(SEQ ID 11)(小鼠和大鼠钙蛋白酶抑制蛋白)PVSREEKPTSAPSS(SEQ ID 12)(人α-A-晶体蛋白)PVSREEKPSSAPSS(SEQ ID 13)(小鼠和大鼠α-A-晶体蛋白)KSTVLQQQYNR(SEQ ID 14)(人踝蛋白)以登记号为XP045856公开的序列(人细丝蛋白2)以登记号为P10809公开的序列(人热激蛋白60)以登记号为NP004355公开的序列(人c/EBPβ)以登记号为P17655公开的序列(人m-钙蛋白酶)。在第三个实施方案中，所述的包含可被钙蛋白酶3或其同工型裂解的肽是用钙蛋白酶3或其同工型筛选肽文库所获得的。为使得接下来能通过显色法或荧光测定法检测钙蛋白酶的活性，上述的本专利技术的肽与生色的或荧光报道分子相偶联。当所述的报道分子是生色分子时，钙蛋白酶3对所述氨基酸序列的裂解在分光光度计上通过有色化合物的出现来检测。实践中所应用的有色化合物是对硝基苯胺。也可以是硫酯。当所述的肽与荧光化合物偶联时，通过荧光发射的改变检测所述的裂解。在此种情况下，实践中所用的荧光化合物是4-甲基-7-香豆酰胺(MCA)或萘胺。萘酰胺和4-甲基-7-香豆基酰胺可用作生色的或荧光底物。在另一实施方案中，所述的可被钙蛋白酶3裂解的肽的两端与两种荧光化合物相偶联，通过，由于裂解后继发的间隔而引起的第一化合物(供体分子)、及当两分子相接近时定位于所述肽另一端并可吸收第一化合物荧光的第二化合物(受体分子)的荧光发射改变检测所述的裂解。已知这一技术被称为FRET(荧光共振能量转移)(Frster，1948)。更具体地说，FRET是一种两荧光分子在一定本文档来自技高网...

【技术保护点】
与至少一种荧光或发光报道分子相偶联的肽，其特征在于，它包含至少一种能被钙蛋白酶３或钙蛋白酶３的同工型裂解的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：I里查德，G西伦，
申请(专利权)人：吉尼索恩，法国国家科学研究中心，
类型：发明
国别省市：FR[法国]