比色分析方法及其使用的试剂技术

本发明专利技术提供可以短时间且简单地实施可靠的分析的比色分析方法。在滤纸中浸渍含有联吡啶铜络合物及葡萄糖脱氢酶的水溶液，干燥。向其中点上血液等试样，根据葡萄糖浓度，联吡啶铜络合物显红褐色，测定之。由于该反应为一步反应，在５秒以下的短时间内便发生。而且，由于该反应不需要过氧化氢和氧，测定值的可靠性也高。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及比色分析方法及其使用的试剂。
技术介绍
在临床检查及生化检查等领域中，进行葡萄糖、胆固醇等的成分分析，其中的一个方法为比色分析。例如，在葡萄糖的比色分析中，通常，首先使葡萄糖氧化酶作用于葡萄糖(底物)，产生葡萄酸内酯和过氧化氢，在过氧化酶存在下，通过Trinder试剂等显色剂检测过氧化氢。这种通过过氧化氢间接地测定底物浓度的方法，不只限于葡萄糖，也适用于胆固醇等其他的成分分析。但是，原来的比色分析中，存在下述问题。首先，由于不是直接测定分析对象，而是通过过氧化氢间接地测定，所以测定费时间，例如，测定葡萄糖时需要30～60秒。其次，原来的比色分析法中，2种酶反应体系需要同时稳定化，条件设定困难。而且，由于需要氧，原来的比色分析法还存在这样的问题如果氧不足，反应就不充分。
技术实现思路
鉴于上述问题，本专利技术的目的是提供反应体系为一步、分析时间短、分析值可靠的比色分析方法。为达成上述目的，本专利技术的比色分析法，是使氧化还原酶作用于分析对象及通过电子授受而颜色变化的电子授受颜色变化物质，通过测定由于上述分析对象向上述电子授受颜色变化物质的电子传递而发生的上述电子授受颜色变化物质的颜色变化，对上述分析对象进行定性或定量的方法。根据该方法，由于为一步反应，反应体系简单，稳定性好，且测定时间也短(例如，以葡萄糖为底物时，约5秒以下便可测定)，另外由于不通过过氧化氢、且不需要氧，所以分析值的可靠性也高。本专利技术的试剂为上述本专利技术的比色分析方法使用的试剂，为含有氧化还原酶及通过电子授受而颜色变化的电子授受颜色变化物质的试剂。本专利技术的试验片为含有上述本专利技术的试剂的试验片。该试验片与原来通过过氧化氢进行比色分析的试验片相比，可在极短的时间内进行分析，分析值的可靠性也高。有将联吡啶金属络合物作为发光物质使用的分析方法(特开平10-253633号公报等)，本专利技术是关于比色分析方法，所以上述分析方法与本专利技术
完全不同。同样，也有通过电极直接外加使联吡啶金属络合物发生显消色反应的技术(例如，特开昭57-192483号公报)，由于本专利技术是利用通过氧化还原酶的电子授受，所以上述技术也与本专利技术
完全不同。附图说明图1为表示本专利技术一实施例中反射率的葡萄糖浓度依赖性的图。图2为表示本专利技术其他实施例中反射率的葡萄糖浓度依赖性的图。图3为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图4为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图5为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图6为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图7为表示本专利技术其他实施例中反射率的葡萄糖浓度依赖性的图。图8A～图8F为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图9A～图9D为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图10A～图10C为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图11为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图12为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图13A～图13C为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图14为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图15为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图16A～图16E为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图17A和图17B为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。图18A～图18C为表示本专利技术其他实施例中颜色变化的图。具体实施例方式在本专利技术的比色分析方法、试剂及试验片中，上述电子授受颜色变化物质优选为过渡金属络合物。过渡金属络合物优选为铜络合物、铁络合物、钌络合物或锇络合物或它们2种以上的混合物。上述过渡金属络合物的配体的配位原子优选为氮、氧及硫中的至少一种。上述配体例如优选为氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲绕啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸及上述各化合物的衍生物。上述配体的配位位置以外的氢原子中的至少一个可以被取代基取代。上述取代基例如有烷基、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基。上述过渡金属络合物也可以具有2种以上的配体。即上述络合物也可以是混合配体络合物。在本专利技术的比色分析方法、试剂及试验片中，氧化还原酶优选为脱氢酶或氧化酶。如果酶量多，反应变快，所以优选。分析对象例如有葡萄糖、胆固醇、尿酸、乳酸、丙酮酸、肌酸、肌酸酐等，这时的氧化还原酶为对应于上述各物质的脱氢酶或氧化酶。在本专利技术的比色分析方法、试剂及试验片中，除了电子授受颜色变化物质，还优选使用介质。上述电子授受颜色变化物质也是介质，它不只具有电子授受的功能，还兼具颜色变化的功能。因此，追加使用的介质是与上述电子授受颜色变化物质不同的介质。如果使用介质，电子授受速度提高，因此上述电子授受颜色变化物质的颜色变化的速度也提高。结果，可以减少氧化还原酶的用量，从成本上看有利。上述介质例如有锇络合物、钌络合物等，具体例子如后文所述。作为电子授受颜色变化物质与介质的组合，优选电子授受颜色变化物质为铜络合物、介质为锇络合物或钌络合物的组合。在本专利技术的试验片中，除了上述试剂，还优选含有无机凝胶。上述颜色变化物质通过电子传递被还原，发生颜色变化，周围有氧时，可能被再氧化而发生褪色，如果含有无机凝胶，可以防止这种褪色。下面举具体例子更详细地说明本专利技术。如上所述，在本专利技术中，电子授受颜色变化物质优选为过渡金属络合物，在过渡金属络合物中，优选铜络合物、铁络合物、钌络合物及锇络合物。(铜络合物)铜络合物通过酶的电子传递，例如颜色从蓝色(Cu2+)变成红褐色(Cu+)。作为铜络合物的配体，例如有氨、联吡啶化合物、咪唑化合物、菲绕啉化合物、乙二胺化合物、氨基酸、三嗪化合物、联喹啉化合物、吡啶基偶氮化合物、亚硝基化合物、8-羟基喹啉化合物、苯并噻唑化合物、乙酰丙酮化合物、蒽醌化合物、呫吨化合物、草酸及上述各化合物的衍生物等配体。上述配体也可以2种以上组合成混合配体。在联吡啶的情况下，配位数为4或6，但从稳定性的观点看，联吡啶优选配位2个。联吡啶可以未取代，也可以引入取代基。通过引入取代基，例如可以调节溶解度、氧化还原电位等。取代位置有4、4′位及5、5′位。取代基有烷基(例如甲基、乙基、丙基等)、芳基、烯丙基、苯基、羟基、烷氧基(例如甲氧基、乙氧基等)、羧基、羰基、磺基、磺酰基、硝基、亚硝基、伯胺、仲胺、叔胺、氨基、酰基、酰胺基及卤素基(例如溴、氯、碘等)。联吡啶铜络合物的例子，例如有二联吡啶合铜、二(4，4’-二甲基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二苯基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二氨基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二羟基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二羧基-2，2’-联吡啶)合铜、二(4，4’-二溴-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二甲基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二苯基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二氨基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二羟基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二羧基-2，2’-联吡啶)合铜、二(5，5’-二溴-2，2’-联吡啶)合铜、三联吡啶合铜、三(4，4’-二甲基-2，2’-联本文档来自技高网...

【技术保护点】
使氧化还原酶作用于分析对象及通过电子授受而颜色变化的电子授受颜色变化物质，通过测定由于上述分析对象向上述电子授受颜色变化物质的电子传递而发生的上述电子授受颜色变化物质的颜色变化，对上述分析对象进行定性或定量的比色分析方法。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：永川健儿，辻本朋吾，西野进，寺元正明，川濑喜幸，
申请(专利权)人：爱科来株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]