以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术涉及一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其检测方法，属于核酸检测领域，具体是根据新型冠状病毒核酸N基因序列设计特异性引物，利用优化的高分辨率熔解曲线反应体系检测新型冠状病毒核酸，操作简单、速度快、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作。

【技术实现步骤摘要】
以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
冠状病毒（Coronavirus，CoV）是一类严重危害人类和畜禽健康的致病微生物，普遍存在于自然界中，自然宿主包括人、牛、猪、犬、禽、猫、蝙蝠、鼠等，广泛宿主特点和自身基因组结构使其演变过程中较易发生基因变化，呈现基因遗传多样性，新冠状病毒和亚型不断出现。高分辨率熔解曲线技术可作为一种新的新型冠状病毒核酸的检测手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行核酸检测，具有操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。该方法可为口岸新型冠状病毒核酸检测和新型冠状病毒的防控提供技术支撑。高分辨率熔解曲线技术可作为一种新的新型冠状病毒核酸的检测手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行核酸检测，具有操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。该方法可为口岸新型冠状病毒核酸检测和新型冠状病毒的防控提供技术支撑。
技术实现思路
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本专利技术提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒检测核酸试剂盒及其检测方法可作为新型冠状病毒核酸新的检测手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行新型冠状病毒检测，操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。并提供其操作方法。本专利技术是由以下技术方案来实现的：本专利技术设计了一组以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸特异性检测引物，序列如下：N-F：5’-GTGATGCTGCTCTTGCTT-3’；N-R：5’-TTCCTTGGGTTTGTTCTG-3’。利用上述的检测引物，本专利技术提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包括如下成分：1）新型冠状病毒N基因的特异性引物N-F：5’-GTGATGCTGCTCTTGCTT-3’N-R：5’-TTCCTTGGGTTTGTTCTG-3’。2）PCR混合液：ExTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料；3）新型冠状病毒核酸逆转录的cDNA；4）ddH2O；5）25mMMgCl2。本专利技术还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测方法，包括如下步骤：1）高分辨率熔解曲线模板新型冠状病毒核酸的制备使用TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒说明提取新型冠状病毒核酸。2）新型冠状病毒基因组RNA逆转录成cDNA使用PrimeScript™II1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒说明将新型冠状病毒核酸逆转录成cDNA。3）高分辨率熔解曲线反应体系：30μL反应体系包括：ExTaqDNA聚合酶0.5μL，新型冠状病毒核酸逆转录的cDNA模板2μL，dNTP混合液2μL，ResoLight饱和荧光染料1μL，N-F引物1μL，N-R引物1μL，反应缓冲液3μL，25mMMgCl23.6μL，ddH2O15.9μL。4）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性5min。94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用LightCycler®480GeneScanningSoftware软件分析高分辨率熔解曲线。本专利技术的一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及操作方法，根据新型冠状病毒核酸N基因序列设计特异性引物，可对新型冠状病毒核酸进行检测，与现有检测手段相比，本专利技术的有益效果在于：1）可对新型冠状病毒核酸的灵敏性和特异性进行有效检测。2）本专利技术设计的引物，灵敏度高，特异性强。3）操作简单、速度快，当天即可出具结果。4）PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。附图说明图1：新型冠状病毒核酸和其他对照病毒核酸以及阴性对照的N基因PCR结果图。图2：新型冠状病毒核酸N基因（蓝线）和其他对照病毒核酸（橙线）以及阴性对照（橙线）的高分辨率熔解曲线图。横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。图3：新型冠状病毒核酸N基因重复性的高分辨率熔解曲线图。横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。图4：新型冠状病毒核酸N基因敏感性的高分辨率熔解曲线图。横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度。具体实施方式下面利用实施例对本专利技术作进一步描述。实施例1本实施例设计了一组以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸特异性检测引物，其特征是，序列如下：N-F：5’-GTGATGCTGCTCTTGCTT-3’N-R：5’-TTCCTTGGGTTTGTTCTG-3’。利用上述的检测引物，本实施例还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，包括如下成分：1）新型冠状病毒核酸N基因的特异性引物N-F：5’-GTGATGCTGCTCTTGCTT-3’N-R：5’-TTCCTTGGGTTTGTTCTG-3’。2）PCR混合液：ExTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料；3）新型冠状病毒核酸逆转录的cDNA；4）ddH2O；5）25mMMgCl2。本实施例还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测方法，包括如下步骤：1）高分辨率熔解曲线模板新型冠状病毒核酸的制备使用TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒说明提取新型冠状病毒核酸。2）新型冠状病毒核酸逆转录成cDNA使用PrimeScript™II1stStrandcDNASynthesisKit试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测特异性引物，其特征是，序列如下：/nN-F：5’- GTGATGCTGCTCTTGCTT -3’；/nN-R：5’- TTCCTTGGGTTTGTTCTG -3’。/n

【技术特征摘要】
1.以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测特异性引物，其特征是，序列如下：
N-F：5’-GTGATGCTGCTCTTGCTT-3’；
N-R：5’-TTCCTTGGGTTTGTTCTG-3’。


2.以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测试剂盒，其特征是，它包括如下成分：
1）新型冠状病毒核酸N基因的特异性引物
N-F：5’-GTGATGCTGCTCTTGCTT-3’；
N-R：5’-TTCCTTGGGTTTGTTCTG-3’；
2）PCR混合液：ExTaqDNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料；
3）新型冠状病毒核酸；
4）ddH2O；
5）25mMMgCl2。


3.以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒核酸检测方法，其特征是，它包括如下步骤：
1）高分辨率熔解曲线模板新型冠状病毒核酸的制备
使用TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKitVer.5.0试剂盒(TaK...

【专利技术属性】
技术研发人员：滕新栋，刘海江，赵风源，陈晓光，
申请(专利权)人：青岛国际旅行卫生保健中心青岛海关口岸门诊部，
类型：发明
国别省市：山东;37