一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种检测covid‑2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用，属于核酸杂交技术领域。RNA探针核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，制备过程包括：设计引物、构建重组质粒、PCR扩增和体外转录；本发明专利技术将制备得到的探针应用于检测covid‑2019中，能够在单细胞水平检测covid‑2019病毒核酸，提高了检测的灵敏度、准确性和特异性。

【技术实现步骤摘要】
一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用
本专利技术涉及核酸杂交
，具体涉及一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用。
技术介绍
2019新型冠状病毒(covid-2019)，其潜伏期长、侵染力强，主要攻击动物体的肺部，引起肺部感染。目前鉴定新型冠状病毒有荧光定量PCR法和抗体检测方法，其中核酸检测方法为检验病毒方法的金标准，但是现有方法中仍存在诸多问题，诸如：(1)荧光定量PCR能够鉴定疑似患者体内的核酸，该方法需要提取细胞中的RNA，随后进行反转录，然后进行PCR鉴定，在这些实验操作中RNA的损失比较多，如果疑似患者处于感染早期或者体内本身含有病毒量比较少，很容易导致RNA在提取过程中丢失，导致假阴性结果出现。(2)由于新型冠状病毒是RNA病毒，RNA病毒变异速度快，并且该变异能够不断进行累积，荧光定量PCR实验对核酸序列要求比较高，尤其是在PCR引物覆盖的区域要求比较苛刻，如果该区域核酸发生突变，导致PCR扩增效率降低甚至不能扩增出来，从而产生假阴性结果。(3)荧光定量PCR实验未经过测序鉴定，有可能扩增出非目的片段，出现假阳性现象，造成了检测结果的不准确。RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或cRNA分子，其是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高，可以检测到单个细胞中是否含有目的RNA，因此，可以有效检测出待测目的片段。<br>因此，如何提供一种可以有效检测covid-2019的探针，并将其应用于检测covid-2019中是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种检测covid-2019冠状病毒的RNA探针及其制备方法与应用。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针，RNA探针的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术还提供了上述的RNA探针的制备方法，步骤如下：1)引物设计与合成：根据covid-2019待测区域核苷酸序列设计合成上游引物和下游引物；2)构建重组载体：将covid-2019待测区域的核苷酸序列插入至表达载体中，得到带有covid-2019待测区域核苷酸序列的重组载体；3)PCR扩增：利用步骤1)合成的上游引物和下游引物PCR扩增重组载体，所得PCR扩增产物纯化后得到covid-2019待测区DNA片段；4)体外转录：以covid-2019待测区DNA片段为模板进行体外转录，合成反义RNA探针。其中，步骤1)下游引物的5’端含有T7RNA聚合酶启动子序列；步骤3)反应体系为50μL：pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-191μL，COVID-19-F13μL，COVID-19-R13μL，5×enhancebuffer10μL，2×PCRmix25μL，ddH2O8μL；PCR扩增的反应程序为：98℃5min；98℃30s、59℃30s、72℃30s，30个循环；72℃4min；使用胶回收试剂盒进行回收纯化处理；步骤4)反义RNA探针带有地高辛标记，体外转录的体系20μL：10×Buffer2μL、带有地高辛标记的rNTP混合物(10mM)4μL、T7RNA聚合酶mix2μL、DNA模板8μL、Nuclease-FreeWater4μL；转录过程为：将体外转录体系加入到1.5mLEP管中，混匀后，于37℃水浴2h；水浴结束后，加入DNase消化15min，然后以琼脂糖电泳检测；用RNeasyMinikit试剂盒纯化转录成功的RNA，最终得到带有地高辛标记的反义RNA探针，保存于-80℃环境中。传统探针合成过程，要对重组质粒进行酶切线性化，再纯化回收后进行大量扩增。本专利技术对构建的重组质粒pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19直接进行PCR扩增，从而得到大量目的片段，与传统技术相比，省去了细菌培养、质粒提取及鉴定、酶切线性化的过程。优选的：上游引物为COVID-19-F1，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，下游引物为COVID-19-R1，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；covid-2019待测区域的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。优选的：表达载体为pcDNA3.1-myc-HisA载体，重组载体为pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19。本专利技术还提供了上述的RNA探针在制备检测新型冠状病毒covid-2019的试剂盒或试剂中的应用。由于covid-2019含有多种突变，并且变异还在不停的加速积累中，本专利技术开发了可以特异性与covid-2019杂交的RNA探针，该探针的长度为844nt，即使在目标序列中有1个甚至多个核酸发生突变，也可以与RNA的大部分碱基序列杂交，不会影响整体的杂交效果。本专利技术还提供了一种非诊断治疗目的检测新型冠状病毒covid-2019的方法，步骤如下：(1)杂交预处理：取待测样本进行预处理；(2)预杂交：将预杂交液加入到处理后的样本中，进行孵育；(3)杂交：除去预杂交液，将待测样本和杂交液混合，进行孵育；(4)杂交后处理：除去杂交液，将孵育后的RNA探针回收，漂洗待测样本后和阻断溶液混合，孵育得到杂交样本；(5)显色、照相：将杂交样本加入到含有终体积分数为1％的羔羊血清的MABT溶液中，清洗后再以MABT溶液清洗，然后以检测缓冲液清洗；加入AP底物染色缓冲液进行室温孵育，包裹避光，当待测样本着色出现后，用PBS溶液清洗，显微镜观察，照相。优选的：杂交预处理是指将待测样品经蛋白酶K消化后，经PBST溶液漂洗后经多聚甲醛固定，再用PBST溶液漂洗。具体步骤为：向待测样本滴加200μL蛋白酶K(10ng/μL)，于37℃孵育30min；用DEPC水配制的PBST溶液漂洗3次，每次5min；用DEPC水配制的4％多聚甲醛固定20min；用DEPC水配制的PBST溶液漂洗3次，每次5min；优选的：步骤2)预杂交液用量200ul由以下成分构成：体积比50％的甲酰胺、5×SSCT、50μg/mL肝素、pH值8.0的5mMEDTA、50μg/mL核糖体RNA、1.84％V/V1M柠檬酸和0.1％V/VTween。具体步骤为：使用24孔培养皿，每1×105个待测细胞样本滴加200μL预杂交液，再置于68℃水浴锅中水浴60min。优选的：杂交液用量200μL，由预杂交液用量200ul和检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针混合构成，其中RNA探针终浓度为2ng/μL。优选的:步骤4)具体步骤依次为：吸出杂交液，将孵育后的RNA探针回收，加入200ul68℃预热的体积比50％的甲酰胺/2×SSCT缓冲液中洗2次，每次30min；68℃预热的2×SSCT缓冲液中洗1次，30min；68℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针，其特征在于，所述RNA探针的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测新型冠状病毒covid-2019的RNA探针，其特征在于，所述RNA探针的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。


2.权利要求1所述的RNA探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：
1)引物设计与合成：根据covid-2019待测区域核苷酸序列设计合成上游引物和下游引物；
2)构建重组载体：将所述covid-2019待测区域的核苷酸序列插入至表达载体中，得到带有covid-2019待测区域核苷酸序列的重组载体；
3)PCR扩增：利用步骤1)合成的上游引物和下游引物PCR扩增所述重组载体，所得PCR扩增产物纯化后得到covid-2019待测区DNA片段；
4)体外转录：以所述covid-2019待测区DNA片段为模板进行体外转录，合成反义RNA探针。


3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述上游引物为COVID-19-F1，核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，所述下游引物为COVID-19-R1，核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述covid-2019待测区域的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。


4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述表达载体为pcDNA3.1-myc-HisA载体，所述重组载体为pcDNA3.1-myc-HisA-COVID-19。


5.权利要求1所述的RNA探针在制备检测新型冠状病毒covid-2019的试剂盒或试剂中的应用。


6.一种非诊断治疗目的检测新型冠状病毒covid-2019的方法，其特征在于，步骤如下：
(1)杂交预处理：取待测样本进行预处理；
(2)预杂交：...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢华平，袁春燕，陈湘定，谢缤灵，胡昱瑶，孙鲁宁，印遇龙，
申请(专利权)人：湖南师范大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43