分泌性多肽的检测制造技术

本发明专利技术涉及检测由细胞产生的分泌性多肽的方法，以及选择产生高水平的所述分泌性多肽的细胞的方法。所述方法可用来选择产生高水平分泌性多肽的细胞，所述多肽由已导入细胞中的异源核酸编码。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测分泌性多肽的方法，更具体涉及选择产生高水平分泌性多肽的细胞的方法。
技术介绍
分泌性蛋白质通常在它们的氨基末端包含信号序列，该序列将合成它们的核糖体指引到内质网(ER)。在连接到粗面ER膜的核糖体上完成蛋白质合成。完成的多肽链移动到高尔基复合体，然后被分选(sort)到不同目的地。合成并在分泌途径中被分选的蛋白质不仅包括那些从细胞分泌的蛋白质，而且包括在ER的腔(lumen)、高尔基体和溶酶体中的蛋白质，以及在这些细胞器的膜和浆膜上的整合蛋白质。大多数在ER新制成的蛋白质掺入(incorporated into)小转运小泡(vesicle)，所述小泡或者融合到高尔基体内侧(cis-Golgi)或者互相融合形成称为高尔基体内侧内质网的膜的堆积(stack)。一些蛋白质从所述高尔基体内侧通过不同组(set)的逆向(retrograde)转运小泡回收到(retrieved)ER。在称为潴泡迁移(cisternal migration)的过程中，新的高尔基体内侧膜集合及其携带的腔蛋白质从内侧位(离所述ER最近)物理移动到外侧位(离所述ER最远)，成功首先变成高尔基体中间(medial-Golgi)潴泡，然后变为高尔基体外侧(trans-Golgi)潴泡。在此过程中，膜和腔蛋白质不断通过小的逆向转运小泡从后期高尔基潴泡回收到早期高尔基体潴泡。通过此过程，酶和其它高尔基体居留蛋白质定位在高尔基体内侧潴泡、高尔基体中间潴泡、或高尔基体外侧。最终要从细胞分泌的蛋白质通过潴泡迁移到高尔基体的外侧面，然后进入称为高尔基体外侧内质网的小泡复合体网络。从那里，分泌性蛋白质被分选到分泌小泡。在所有的细胞种类里，至少一些所述分泌性蛋白质是持续分泌的。这些蛋白质在高尔基体外侧网络中分选进入转运小泡，该小泡立即移动到浆膜并与之融合，通过胞吐作用(exocytosis)释放出它们的内容物。在一些细胞中，具体一系列(set)蛋白质的分泌不是持续的。这些蛋白质在高尔基体外侧网络分选进入分泌性小泡，所述分泌性小泡储藏在细胞内部等待刺激来进行胞吐，所述刺激例如激素与其受体的结合。
技术实现思路
本专利技术基于，至少部分基于可在产生分泌性多肽的细胞表面检测该多肽这一发现。分泌性多肽在细胞表面的检测可用作细胞产生分泌性多肽的标志。因此，此方法可用来选择产生高水平的给定分泌性多肽的细胞。本专利技术一方面的涉及选择产生分泌性多肽的细胞的方法，所述方法包括提供细胞群(population)，其中所述细胞群包含含有编码分泌性多肽的异源核酸的细胞；使所述细胞群接触特异性结合所述分泌性多肽的化合物；检测所述化合物与所述细胞表面上的分泌性多肽的结合；并基于与所述细胞表面上的分泌性多肽结合的化合物的存在或量筛选所述细胞。另一方面，本专利技术的特征是制备产生分泌性多肽的细胞的方法，所述方法包括将编码分泌性多肽的异源核酸引入细胞；在允许合成所述分泌性多肽的条件下培养所述细胞；使所述细胞接触特异性结合所述分泌性多肽的化合物；通过所述化合物与所述细胞表面上所述分泌性多肽的结合，检测所述分泌性多肽的表达；并通过荧光激活细胞分选筛选所述细胞。“分泌性多肽”指合成并在细胞分泌途径中被分选的蛋白质，之后从所述细胞以可溶形式释放。“分泌性多肽”通常包含氨基末端信号序列，它在所述多肽从所述细胞释放前被切割。“分泌性多肽”不指这样一类蛋白质，其以完整的膜蛋白质的形式存在或通过切割完整的膜蛋白质从细胞释放，例如，所述切割事件释放完整膜蛋白质的可溶细胞外区域。“选择细胞”指将细胞指定到(assign to)给定物理位置的过程。本专利技术上下文中，基于结合所述细胞表面上分泌性多肽的化合物的存在或量，细胞被指定到物理位置。不具有所需特征的细胞通常不被指定到与所选择的细胞相同的物理位置。术语“选择细胞”包括，例如，基于通过流式细胞法(flowcytometry)鉴定的细胞的荧光性质，将细胞(可选与其它具有相同或相似特征的细胞一起)保存在收集容器中。其它选择细胞的方法实例包括磁分离(magnetic separation)和淘选(panning)技术。“异源核酸”指通过使用重组技术已被导入细胞的核苷酸序列。因此，存在于给定细胞中的“异源核酸”不天然地存在于所述细胞中(例如，在所述细胞的基因组中无对应的相同序列)，和/或存在于细胞中与对应相同序列天然存在的位置不同的位置(例如，所述核苷酸序列存在于所述细胞基因组的不同位置，或作为不整合到基因组的构建体存在所述细胞中)。“异源核酸”不指存在于两个或多个细胞的细胞融合事件所得细胞中的核苷酸序列。所述细胞可以是，例如真核细胞(例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)(CHO)细胞或COS细胞)或原核细胞。所述细胞可以衍生自细胞系或可以是原代细胞。一项实施方案中，所述细胞不是转化的细胞。另一实施方案中，所述细胞不是B细胞或通过B细胞和其它细胞融合形成的细胞。所述分泌性多肽可以是抗体，例如人源化抗体。所述化合物可以是标记的，例如荧光标记的。所述化合物可以是抗体，例如荧光标记的抗体。一项实施方案中，通过流式细胞法来检测所述抗体与所述细胞表面上所述分泌性多肽的结合。通过荧光激活的细胞分选法可选地筛选所述细胞。所述细胞可以与细胞群中多个细胞一起被选择，所述多个细胞显示与所述多个细胞的表面上的分泌性多肽结合的化合物。所述多个细胞可选包含，例如，所述细胞群中至少1％，5％，10％，20％，30％，40％，50％，或更多的细胞。所述多个细胞可选包含所述细胞群中不超过例如，至少1％，5％，10％，20％，30％，40％，或50％的细胞。所述细胞可以被保存在包含所述细胞但不含其他细胞的容器中。本文所述的方法可还包括培养所选择的细胞来产生所述分泌性多肽的第二细胞群；使该第二细胞群接触所述抗体；检测所述抗体与第二细胞群细胞表面上所述分泌性多肽的结合；并基于结合于所述细胞表面上所述分泌性多肽的抗体的存在或量，通过荧光激活的细胞分选法，筛选所述第二细胞群的细胞。一项实施方案中，在4℃到10℃，例如在大约4℃，使所述细胞群接触所述抗体。本文所述的方法可还包括在允许所述分泌性多肽分泌到所述培养基的条件下培养基中培养所选择的细胞；并从所述培养基纯化所述分泌性多肽。另一方面，本专利技术涉及确定细胞产生的分泌性多肽的存在或量的方法，所述方法包括使产生分泌性多肽的细胞接触特异性结合所述分泌性多肽的化合物，其中所述细胞不是B细胞或通过B细胞和其它细胞融合形成的细胞；并检测所述细胞表面上所述分泌性多肽与所述化合物的结合，从而确定由所述细胞产生的分泌性多肽的存在或量。一项实施方案中，所述细胞包含编码所述分泌性多肽的异源核酸。所述细胞可以是，例如真核细胞(例如，哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或COS细胞)或原核细胞。所述细胞可以是衍生自细胞系或可以是原代细胞。一项实施方案中，所述细胞不是转化的细胞。所述分泌性多肽可以是抗体，例如人源化抗体。所述化合物可以是标记的，例如荧光标记的。所述化合物可以是抗体，例如荧光标记的抗体。一项实施方案中通过流式细胞法来检测所述抗体与细胞表面上分泌性多肽的结合。通过荧光激活的细胞分选法可选地筛选所述细胞。另一方面，本本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生分泌性多肽的细胞的选择方法，所述方法包括：提供细胞群，其中所述细胞群包含一种细胞，所述细胞包含编码分泌性多肽的异源核酸；使所述细胞群与特异性结合所述分泌性多肽的化合物接触；检测所述化合物与所述细胞表面上的分泌性多 肽的结合；并且基于与所述细胞表面上所述分泌性多肽结合的化合物的存在或量来选择细胞。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：格雷格蒂尔，
申请(专利权)人：比奥根艾迪克MA公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]