细胞锌离子检测用的氟硼染料荧光探针制造技术

本发明专利技术涉及一类新型基于分子内光诱导电子转移（ＰＥＴ）原理的锌离子荧光分子探针，该探针是通过一系列拥有８位氯甲基的氟硼荧光染料与二（２－吡啶甲基）胺简单连接而成。激发和发射波长在可见区。探针分子本身具有良好的化学、光稳定性。该系列探针具有很低的ｐＫ↓［ａ］值，一般在２到３。在ｐＨ４到１０的范围内，ｐＨ变化对荧光发射没有影响。对锌离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、锰、铁等金属离子对检测没有干扰。可以检测纳摩尔浓度的锌离子。探针分子－锌离子络合物量子产率高，络合前后荧光量子产率至少有十几倍的增长。荧光显微成像实验表明这类探针细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，特别适于细胞内锌离子浓度变化的检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞锌离子检测用荧光分子探针。
技术介绍
锌离子是生物体中的一种二价金属离子，也是生物体中继铁之后第二富集的过渡金属。大量的锌离子都集中在神经组织中，如在脑组织中的浓度是0.1-0.5mM。尽管生物体中大部分的锌离子都与蛋白质紧紧结合，但在某些细胞中仍然存在着“游离锌池”，游离锌的浓度在各种哺乳细胞内低至纳摩尔级。迄今为止，人们已经认识到锌在生命过程中起着许多不同的作用。其中最重要也是最广为人知的作用就是在金属蛋白中作为一种构造因子。同时，锌离子通过金属调整蛋白直接参与调整基因表达。还有生物体内外的大量证据都说明锌在细胞凋亡中是一种重要的调整元素。另外，锌离子存在于大部分的DNA和RNA聚合酶中。锌离子能够从突触囊中释放出来并通过电位调控型钙离子信道进入细胞，这表明游离锌离子还具有神经调节功能。对金属离子的检测已经存在很多方法，比如原子吸收、电子顺磁共振等，但是这些方法不能够对生物体内离子进行实时检测，且这些方法测定时样品的预处理比较复杂，所以应用受到一定的限制。由于荧光探针法具有灵敏度高、选择性好、反应时间快、能够进行实时区域离子测试，而受到普遍的重视。理想的锌离子荧光分子探针应具有以下性质化学-光稳定性高、激发波长在可见光区(≥400nm)、对锌离子荧光有选择性和敏感性好、快速响应、对细胞pH环境不敏感、脂溶性兼水溶性、对细胞毒害作用小。目前存在能够进行细胞锌离子检测用荧光探针主要有以下两类喹啉衍生物锌离子荧光探针是一种开发比较早且适于细胞检测的探针，6-甲氧基-8-对甲苯磺酰胺喹啉(TSQ)是第一例用于大脑、心脏及其它组织切片中锌离子浓度检测的荧光分子探针。但这类探针激发波长处于紫外区(～350nm)，容易被生物本体自荧光干扰，并且短的激发波长还会对细胞产生伤害。因此这种探针的应用受到了一定的限制。荧光素衍生物锌离子荧光探针是近年来发展比较多的一类探针，这类探针因为拥有激发波长在可见区(～500nm)，量子产率高等优点而受到重视。具有代表性的探针是zinpyr系列探针及ZnAF系列探针。这类探针最大的不足就是对pH变化比较敏感，pKa值6至9左右，这源于荧光素母体本身对pH的敏感性。这类探针在研究pH较小或者是pH变化较大环境中的锌离子变化受到限制。另外存在的问题就是这类探针分子合成起来一般比较困难，结构比较复杂，大量工业化会有一定困难。
技术实现思路
本专利技术的目的改进现有的细胞锌离子荧光探针性能和结构上的不足，设计合成出适用于细胞锌离子检测、性能优良的基于氟硼荧光染料的探针分子作为研究目标。第一、本专利技术荧光探针分子激发和发射光谱在可见区，荧光量子产率高，对溶剂极性不敏感，并且化学—光稳定性好。第二、本专利技术荧光探针分子的设计基于分子内光诱导电子转移(PET)原理，探针分子络合锌离子前后荧光量子产率至少有12倍的增长。荧光探针分子对锌离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、锰、铁等金属离子对检测没有干扰。另外荧光探针分子对pH变化不敏感，pKa值2到3，在pH 4到10的范围内，pH变化对荧光发射没有影响。第三、本专利技术荧光探针分子与锌离子之间的络合常数在纳摩范围内，可以检测纳摩尔浓度的细胞锌离子。探针分子细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，适于细胞内锌离子浓度变化的检测。氟硼染料作为优良的荧光母体已经被用来合成很多类型的探针，但是所有已经存在的探针是借用中位为苯环的染料母体，然后再作相应的衍生化，这样后期合成就较为复杂。本专利技术避开常规，借用8位氯甲基的氟硼荧光染料，后期合成变得极为简单。且连接基团亚甲基比亚苯基短，借用PET原理时较中位苯环的氟硼染料体系更有效。本专利技术细胞锌离子检测用的氟硼染料荧光探针具有下列结构通式 通式中R1，R2，R3＝H或C1-12烷基。本专利技术代表性的化合物显示在下面的合成方案中，在本说明书的实施例中更详细的说明了该探针的合成和分析检测方法。 在常温、惰性气体保护下，氯乙酰氯与二当量的吡咯在二氯甲烷中缩合，然后加入三乙胺和三氟化硼，室温继续反应，得到8位氯甲基化的氟硼荧光染料中间体，经柱分离得纯品，然后该中间体与二(2-吡啶甲基)胺在四氢呋喃中反应得到探针分子，最后经过柱分离得到探针纯品。本专利技术的氟硼染料荧光探针使用方法没有特殊的限制，通常，可以将探针分子溶解在生理盐水、缓冲液或由乙醇、乙二醇、二甲基亚砜等水溶性有机溶剂，然后加入含有细胞组织的适当缓冲液中进行测试。本专利技术的氟硼染料荧光探针的具体特征如下探针分子激发在490～500nm范围内，发射在505～515nm范围内，对溶剂极性不敏感，并且化学—光稳定性好；探针分子络合锌离子前荧光量子产率低于0.1，络合锌离子后荧光量子产率高于0.5，锌离子络合前后量子产率至少有12倍的增长；探针分子对锌离子有很好的选择性，钠、钾、钙、镁、锰、铁等金属离子对检测没有干扰；探针分子对pH变化不敏感，pKa值2到3，在pH 4到10的范围内，pH变化对荧光发射没有影响；探针分子与锌离子之间的络合常数在0.5～3纳摩范围内，可以检测纳摩尔浓度的细胞锌离子；探针分子细胞渗透性好，对细胞本身没有毒副作用，适于细胞内锌离子浓度变化的检测。附图说明图1是本专利技术的荧光探针分子3对锌离子具有良好的选择性。横坐标为各种离子，纵坐标为加入金属离子与未加金属离子的探针分子溶液的荧光强度的比值。白色柱代表探针分子溶液加五倍过量的金属离子；黑柱代表探针分子溶液加五倍过量的金属离子和五倍过量锌离子。图2是本专利技术的荧光探针分子3的荧光强度和锌离子浓度的关系。横坐标为波长(nm)，纵坐标为荧光强度。箭头表示锌离子的浓度变化从小到大依次为0，0.25，0.52，0.83，1.17，1.56，2.00，2.52，3.12，3.83，4.68，5.72，7.02，10.92到18.72nM，后几个是加饱和锌离子。图3是本专利技术的荧光探针分子3荧光强度与pH变化关系。横坐标为pH，纵坐标为归一化的荧光强度。图4是本专利技术的荧光探针分子3-锌离子络和物荧光强度与pH变化关系。横坐标为pH，纵坐标为归一化的荧光强度。图5是用本专利技术的荧光探针分子3研究小鼠的嗜铬细胞(PC12)内锌离子浓度变化而产生的荧光变化的荧光显微图。5a是空白PC12细胞，5b是加1μM的ZnCl2，5c是加SNP后PC12细胞的荧光显微成像图。研究探针对锌离子选择性一般的方法是将的探针分子分别加到五倍过量的特定金属离子的缓冲液中，测量荧光强度的大小，结果与未加金属离子的探针分子溶液比较。另外还要比较干扰离子存在下对锌离子的选择性，通常是将探针分子加到五倍过量的特定金属离子与五倍过量的锌离子混合的缓冲液中，测量荧光强度的大小，结果与仅加五倍过量锌离子的探针分子溶液比较。研究探针pH的响应的一般方法是将探针分子加入离子强度为0.1的水溶液中，调节pH值为1.0左右，测定荧光强度后，加入碱液，使pH值缓慢增大，记录相应的荧光强度变化，以荧光变化对pH作图。另外测定锌离子—探针分子络合物与pH的关系一般方法是将含五倍过量锌离子的探针分子溶液中，调节pH值为1.0左右，测定荧光强度后，加入碱液，使pH值缓慢增大，记录相应的荧光强度变化，以荧光变化对pH作图。细胞内锌离子检测的一般方法是将培养好的细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类用于细胞锌离子检测用的氟硼染料荧光探针，其特征在于该氟硼染料荧光探针具有下列结构通式：＊＊＊通式中：Ｒ↓［１］，Ｒ↓［２］，Ｒ↓［３］＝Ｈ或Ｃ↓［１－１２］烷基。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：彭孝军，吴云扣，樊江莉，王静云，郭斌臣，崔爱军，田茂忠，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]