磷酸单酯化合物分子量的求得方法及质谱测定用的添加剂技术

一种磷酸单酯化合物分子量的求得方法，其特征在于，所述方法包括：　　　　（１）将含有由单一的锌同位体构成、且用式（Ⅰ）表示的化合物的配位化合物和受检试样在溶剂中混合，配成溶液后，对所述溶液进行质谱测定的工序；　　　　＊＊＊　　（Ⅰ）　　　　式中，Ｒ↑［１］～Ｒ↑［４］表示氢原子或取代基，　　　　（２）将含有由与所述同位体不同的单一的锌同位体构成、且用式（Ⅰ）表示的化合物的配位化合物和受检试样在溶剂中混合，配成溶液后，对所述溶液进行质谱测定的工序；　　　　（３）通过对所述质谱测定结果进行比较，求得磷酸单酯化合物的分子量的工序。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种含于生物体试样等中的磷酸单酯化合物分子量的求得方法及在该方法中使用的质谱测定用的添加剂。
技术介绍
某种生物体内的酶，在以活性中心为代表的特定部位上具有丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸残基，它们的羟基由被称为激酶的酶进行磷酸化(磷酸单酯化)或脱磷酸化来调节其酶活性。也有的酶是通过赖氨酸、精氨酸、组氨酸的氮及天冬氨酸、谷氨酸的羧基被磷酸化(或脱磷酸化)来调节其酶活性。作为上述藉由磷酸化—脱磷酸化调节的代谢系统，熟知的是糖原合成的抑制及其分解系统。该代谢系统主要由磷酸化—脱磷酸化进行级联控制及调节。近年来，明显的是，上述磷酸化—脱磷酸化在有关疾病的代谢系统中具有重要的作用。例如，对于细胞的癌变，磷酸化—脱磷酸化的异常被认为是一个原因。即，细胞周期的进行及停止由各种各样的酶(蛋白质)的磷酸化(或脱磷酸化)控制，上述磷酸化与周期素及依赖周期素的激酶(CDK)有关。但如果上述功能受到损伤，则磷酸化(或脱磷酸化)发生紊乱，其结果引发细胞的增殖异常。其他，明显的是，蛋白激酶C与作为特应性皮炎(atopic dermatitis)及花粉症(pollenallergy)等过敏性疾病原因的组胺的脱颗粒(degranulation)有关，及发生于阿耳茨海默病患者的脑中的神经原纤维变化(neurofibrillary tangle)也源于磷酸化的T型蛋白质(tau protein)。因此，若能把握生物体试样中的哪一种酶(蛋白质)被磷酸化(或脱磷酸化)，则不仅有利于对生物体组织细胞的基因的发现的探索及酶活性的评价，也可能有利于疾病的诊断、治疗。可是，以往使用的磷酸化蛋白质(或脱磷酸化蛋白质)的检测方法存在各种缺陷。例如，酶免疫法虽然具有即使作为对象的蛋白质试样微量也可进行分析的优点，但要获得足够量的必要的抗体却有困难，另外，对象蛋白质在几个kDa以下时，无法配制结合于蛋白质中的磷酸化部位的抗体。又，有人考虑藉由由放射性同位素32P所标记的磷酸的使用，来检测对蛋白质的特异结合的方法，但使用该方法理所当然地必须注意放射性同位素的处理，对其废液的管理、处理等也有要求。再有，磷酸化蛋白质和脱磷酸化蛋白质的电荷不同，因此，也有人考虑应用二维电泳法。然而，在对生物体试样进行分析的场合，试样中含有多种类的蛋白质，由此，也使得斑点的鉴定非常困难。而且，为了斑点的鉴定而使用放射性同位素，则会发生如上所述的问题。另外，下列非专利文献1(Yashiro Morio等二人，”Preparation and Study of DinuclearZinc(II)complex for the Efficient Hydrolysis of the Phosphodiester Linkage in aDiribonucleotide″，《Journal ofthe chemical Socicty，Chemical communications》，P.1793-1794(1995年))中记载了锌的配位化合物。该锌配位化合物中的两个锌离子具有作用于二核苷酸中的磷酸根，并切断该酸根的功能。然而，非专利文献1中的该配位化合物的功能主要是用作催化剂的，有关与磷酸根的配位结合能，未作任何记载。实际上，根据本专利技术人的实验，该配位化合物和两个核苷之间的磷酸根(磷酸二酯基)的离解常数非常大。即，该配位化合物对磷酸二酯基的配位结合能很低。另外，下列非专利文献2(Hidekazu Arii等六人，”A novel diiron coplex as a functionalModel for hemerythrin″，《Journal of Inorganic Biochemistry》，第82卷，P.153-162(2000年))中也记载了具有类似于上述锌配位化合物结构的铁的配位化合物。但是，所述铁的配位化合物是作为氧分子的传输蛋白质的蚯蚓血红蛋白(hemerythrin)的模型合成的。有关该铁配位化合物与磷酸单酯基的配位结合能未作任何记载，也未作任何启示，这一点如同上述非专利文献1。本专利技术者们已经开发了一种鉴定具有磷酸单酯基的肽等的方法。在该技术中，利用与磷酸单酯基等的阴离子取代基特有地配位结合的配位化合物，例如对使该配位化合物作用的试样和未使该配位化合物作用的试样进行质谱比较，能够得到与磷酸单酯基结合的化合物的信息。也就是说，因为与该配位化合物结合的化合物和未与该配位化合物结合的化合物，应该只在配位化合物部分的分子离子峰的值不同，所以能够知道含有磷酸单酯基的化合物的分子量。可是，单一试样(精制的试样)暂且不说，在含有多个化合物的混合试样的分析中，即使放大记录，也不能鉴定到目的分子离子峰。也就是，在质谱中，因为构成化合物的原子的同位体分布使离子峰的表现方式不同，所以，在与该配位化合物结合的化合物和未与该配位化合物结合的化合物之间，分子离子峰的表现方式不同，峰的鉴定困难。
技术实现思路
在上述状况之下，本专利技术所要解决的课题在于提供一种磷酸单酯化的化合物(蛋白质和糖类等)的分子量的容易的鉴定方法，根据该方法，即使是含有多个化合物的生物体试样，也能容易地从中鉴定磷酸单酯化的化合物(蛋白质和糖类等)的分子量。并且，根据本专利技术，其课题也在于提供一种能使用于上述方法中的质谱测定用的添加剂。为了解决所述课题，本专利技术者们对于已完成开发、显示了相对磷酸单酯基高的结合能的金属配位化合物进行进一步刻意研究，发现使配位有单一的锌同位体的配位化合物作用于受检试样，取得多个质谱测定结果，对这些进行比较的话，能够容易地鉴定磷酸单酯化合物的分子量，由此完成了本专利技术。也就是，本专利技术有关的磷酸单酯化合物的分子量的求得方法，其特征在于，所述方法包括(1)将含有由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受检试样在溶剂中混合，配成溶液后，对所述溶液进行质谱测定的工序； 式中，R1～R4表示氢原子或取代基，(2)将含有由与上述同位体不同的单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物和受检试样在溶剂中混合，配成溶液后，对所述溶液进行质谱测定的工序；(3)通过对上述质谱测定结果进行比较，求得磷酸单酯化合物的分子量的工序。在上述方法中，在受检试样含有磷酸单酯化合物的情况下，在两个质谱中存在出现在不同位置上的分子离子峰。将其两个分子离子峰进行比较，作为化合物(1)，除锌同位体之外基本骨架相同的场合，只在使用的两个锌同位体的分子量差为2倍的值(在对于1个分子的磷酸单酯化合物存在多个磷酸单酯基的场合，该值为再乘上该多个磷酸单酯基数的值)的部分位置错移，且两峰具有大致相同的形状，由此，能够容易地鉴定磷酸单酯化的化合物的分子离子峰，且能求出分子量。作为上述配位化合物(1)，理想的是，R1～R4全都是氢原子。因为在化合物(1)中结构最简单而容易制造，并且分子离子峰更简单化。又，本专利技术的质谱测定用的添加剂，用于求出磷酸单酯化合物的分子量，其特征在于，所述质谱测定用的添加剂含有一种试剂，含有由单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物；以及另一种试剂，含有由与所述同位体不同的单一的锌同位体构成、且用式(I)表示的化合物的配位化合物。 式中，R1～R4表示氢原子或取代基。作为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：小池透，南则雄，川崎昭彦，
申请(专利权)人：株式会社纳德研究所，
类型：发明
国别省市：