本发明专利技术涉及高通量对在人类中导致严重急性呼吸道综合症（ＳＡＲＳ）的病毒（“ｈＳＡＲＳ病毒”）的诊断性试验。具体地说，本发明专利技术涉及高通量逆转录－ＰＣＲ诊断检测ＳＡＲＳ相关的冠状病毒（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）。本发明专利技术试验方法为快速可靠的试验方法，可用于诊断和监测ＳＡＲＳ传播，基于ｈＳＡＲＳ病毒Ｎ（核壳）－基因的核苷酸序列。本发明专利技术方法消除了假阴性结构，并为试验提供了更高的灵敏度。本发明专利技术还公开了ｈＳＡＲＳ病毒的Ｓ（刺突）－基因。本发明专利技术还涉及推断的ｈＳＡＲＳ病毒Ｎ－基因和Ｓ－基因产物的氨基酸序列和Ｎ－基因和Ｓ－基因产物在诊断方法中的用途。本发明专利技术还包括包含抗Ｎ－基因或Ｓ－基因产物抗体的诊断性试验方法和试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求以下申请的优先权2003年3月24日提交的美国临时申请60/457,031、2003年3月26日提交的美国临时申请60/457,730、2003年4月2日提交的美国临时申请60/459,931、2003年4月3日提交的美国临时申请60/460,357、2003年4月8日提交的美国临时申请60/461,265、2003年4月14日提交的美国临时申请60/462,805、2003年4月23日提交的美国临时申请60/464,886、2003年4月25日提交的美国临时申请60/465,738和2003年5月14日提交的美国临时申请60/470,935，它们各自通过引用整体结合到本文中。本申请包含一份长序列表，该序列表通过一式三份的CD-R代替印刷的纸质文本一并提交，其通过引用整体结合到本文中。所述CD-R于2004年3月22日刻录，分别标记为“CRF”、“Copy 1”和“Copy 2”，每个只含有一个相同的1.6MB文件(V9661077.APP)。1.介绍本专利技术涉及对导致人类严重急性呼吸道综合症(SARS)的病毒(“hSARS病毒”)的高通量诊断性试验。具体的说，本专利技术涉及高通量逆转录-PCR诊断性测定SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)。本专利技术试验方法是快速可靠的检测方法，可用于诊断和监测SARS的传播。本专利技术方法消除了假阴性结果，并且为试验提供了高灵敏度。本专利技术进一步涉及用于诊断SARS的核苷酸序列及其部分。本专利技术还涉及用于评价SARS遗传多态性的核苷酸序列及其部分。本专利技术的核苷酸序列包括hSARS病毒的(核壳)N-基因和S-基因序列。本专利技术涉及用于检测hSARS病毒N-基因或S-基因的包含核酸分子的诊断试剂盒。本专利技术还涉及推断的hSARS病毒N-基因和S-基因产物的氨基酸序列。本专利技术还涉及N-基因和S-基因产物在诊断方法中的用途。本专利技术还包括包含产生的抗N-基因或S-基因产物抗体的诊断性试验方法和试剂盒。2.专利技术背景最近，中国大陆的广东省爆发了非典型肺炎。在2002年11月到2003年3月之间，报道了792例病例，其中31例死亡(WHO.SevereAcute Respiratory Syndrome(SARS)Weekly Epidemiol Rec.2003；7886)。患SARS的患者表现出各种临床症状，包括发热(38摄氏度或以上超过24小时)、不适、寒战、头痛和体痛。胸部X-射线表现出可与肺炎相容的改变。其它症状包括咳嗽、呼吸短促或呼吸困难。到2003年5月3号，在香港已累计共发生1621件病例，179人死亡，分别占全球报道病例(6234)和死亡(435)的26％和41％。由于该疾病具有高度传染性，并在日常活动中传播，非常需要开发一种快速和可靠的诊断检测方法以监测和控制该疾病。为应对此次危机，香港医院管理局加强了对严重非典型肺炎患者的监视。在此次调查过程中，确认了多个卫生保健工作者群体患有此病。另外，与此病感染者密切接触的人中出现多个肺炎病例群体。尽管采用了针对已知通常与非典型肺炎有关的细菌病原体的典型抗生素治疗方法，此病的严重程度和发展仍非同寻常。本专利技术的专利技术人(简称本专利技术人)是参与调查这些患者的小组之一。在这些患者中，对常见病毒和细菌的所有鉴定试验结果均为阴性。此外，检测hSARS病毒中其它基因如1b-基因的诊断检测方法不能用于准确诊断SARS。该疾病按严重急性呼吸道综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome)的首字母命名(“SARS”)。该病毒突变和变化得很快，因此诊断SARS非常困难，直到由本专利技术人如本文所公开从SARS患者中分离出该病毒的特有区域，hSARS病毒的N-基因和S-基因。即本专利技术公开了使用该病毒基因组中的特殊区域快速、准确、可靠和特异性鉴定hSARS病毒的诊断性试验方法。本专利技术可用于临床和科学研究用途。此外，本专利技术提供了高通量试验方法，可用作诊断和监测SARS传播的灵敏方法。3.专利技术概述本专利技术基于本专利技术人对hSARS病毒特有区域的鉴定，具体的说，是hSARS病毒基因组的3′区域，尤其是可用于诊断性试验以检测hSARS的hSARS病毒(核壳)N-基因。具体的说，N-基因用于诊断SARS是因为与hSARS病毒中的其它基因相比，N-基因在病毒感染时具有最多的拷贝数，尤其是当细胞裂解时。因此，hSARS病毒N-基因的核苷酸序列尤其可用于对hSARS病毒的快速和可靠的诊断性试验。此外，本专利技术方法消除了假阴性结果，并提高了试验的灵敏度。所述病毒是从在最近爆发于中国的严重非典型肺炎中患上SARS的患者中分离出来的。该分离病毒是正极性有包膜单链RNA病毒，属巢病毒(Nidovirales)目冠状病毒科(Coronaviridae)。hSARS病毒是非常巨大的RNA病毒，由约29,742个核苷酸组成。hSARS病毒的完整基因组序列保藏在Genbank，NCBI，其检索号为AY278491(SEQID NO15)，其通过引用结合到本文中。分离的hSARS病毒于2003年4月2日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，被给予检索号CCTCC-V200303，如下面第7节中所述，其通过引用结合到本文中。同样，hSARS病毒CCTCC-V200303的完整基因组序列及其特征公开于与本文同时在2004年3月24日提交的代理档案号为V9661.0069的美国专利申请中，其通过引用整体结合到本文中。该病毒突变和变化得很快，因而使得诊断SARS非常困难。本专利技术人设计了检测N-基因核苷酸序列或蛋白存在的诊断性试验方法，以快速、准确和特异性鉴定hSARS病毒。此外，本专利技术人设计了诊断性检测S-基因核苷酸序列或蛋白存在的试验方法，以测定hSARS病毒的遗传多态性。因此，本专利技术涉及检测hSARS病毒N-基因和S-基因核苷酸序列的方法。本专利技术提供快速可靠的检测hSARS病毒的试验方法。在优选实施方案中，hSARS病毒的检测包括在聚合酶链反应、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、DNA分析、RNA分析或其它核酸杂交中使用本专利技术核酸分子以检测hSARS核酸。在一个实施方案中，本专利技术提供在生物材料如细胞、鼻咽抽吸物、痰、血、唾液、尿、粪等中检测本专利技术hSARS病毒存在、活性或表达的方法。在优选实施方案中，生物材料为鼻咽抽吸物或粪。样品中hSARS病毒活性或表达相对对照样品的升高或降低可通过使生物材料接触可直接或间接检测hSARS病毒存在、活性或表达的检测试剂而测定。在一个具体实施方案中，检测试剂为本专利技术的核酸分子。本专利技术还涉及鉴定hSARS病毒感染对象的方法，所述方法包括从该对象的生物样品获得总RNA；逆转录总RNA以获得cDNA；和用一套来源于hSARS核苷酸序列的引物使cDNA进行PCR测定。在优选实施方案中，引物来源于(核壳)N-基因。在最优选实施方案中，引物包含SEQ ID NO2475和/或2476或SEQ ID NO2480和/或2481核苷酸序列。在另一个优选实施方案中，引物来源于(刺突)S-基因。在更优选的实施方案中，引物包含SEQ ID NO2477和/或2478核苷酸序列。本专利技术还涉及分离的病毒的序列信息在诊断和治疗方法中的用途。在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的核酸分子，所述核酸分子基本由ＳＥＱＩＤＮＯ：２４７１核苷酸序列或其互补序列组成。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈国雄，管轶，JM黎国思，JSM裴伟士，潘烈文，袁国勇，FC梁，
申请(专利权)人：港大科桥有限公司，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]
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